泛素偶联酶E2C在原发性肝癌中的表达及与临床病理参数和预后的关系

董文亮，刘洪涛，初侃，侯铁伟，肖遥

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，位于世界恶性肿瘤发病率的第6位，致死率第2位，以乙肝细胞癌或丙肝细胞癌最为常见，约占80%[1-2]。据研究统计，我国原发性肝癌患者术后5年生存率约10%[3]。因此研究原发性肝癌发生发展的分子标志物，为原发性肝癌及时诊断、治疗和预后提供依据迫在眉睫。研究发现，泛素偶联酶E2C(UBE2C)过表达能够抑制细胞有丝分裂纺锤体检查点，破坏其监测功能，从而促进肿瘤细胞增殖、侵袭[4-5]。近几年研究表明，UBE2C在乳腺癌、胃癌、食管鳞癌组织中高表达[6-8]，而在原发性肝癌中表达水平及与预后关系未见国内外相关报道。因此，现分析原发性肝癌组织UBE2C表达水平与患者临床病理参数及术后预后的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年1月—2016年12月北部战区总医院普外科手术治疗原发性肝癌患者109例(肝癌组)，术中留取原发性肝癌组织3 mm3，同时取距原发性肝癌组织5 cm处同体积正常肝脏组织为癌旁组。患者中男59例，女50例，年龄39～75(55.24±6.49)岁；病程3～15(8.24±2.93)个月；嗜酒31例(28.44%)；肝炎病毒感染89例(81.65%)；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期69例；分化程度：高中分化39例，低分化70例；有淋巴结转移47例，无淋巴结转移62例；有淋巴结血管间隙浸润54例，无浸润55例。本研究经医院伦理委员会批准通过，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①所有患者经病理诊断确诊为原发性肝癌[9]；②患者临床资料完整、详细，能够接受术后随访；③无既往治疗史和家族遗传史。(2)排除标准：①肾功能异常患者；②并发其他恶性肿瘤患者；③伴有心脏病、糖尿病患者；④合并其他原因引起的肝硬化、肝腺瘤等。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 UBE2C表达检测：采用免疫组化法测定UBE2C在原发性肝癌组织和癌旁组织中表达水平。病理标本均由同一病理科医生独立完成。使用轮转式切片机(RM2016型，德国徕卡公司)常规制作原发性肝癌组织和癌旁组织石蜡切片(厚度约4 mm)，常温下用3% H2O2阻断切片中过氧化氢酶活性，修复抗原，PBS清洗3次，加入UBE2C单克隆抗体(武汉维克赛思科技有限公司)，置于4℃冰箱中过夜，加入二抗(北京百奥莱博科技有限公司)，25℃孵育30 min，随后加入链霉亲和素—过氧化物酶室温孵育15 min，PBS清洗3次，用DAB显色，最后用苏木素复染，60%、80%、90%、100%乙醇梯度洗脱脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，SPCC-200型生物显微镜(购自东莞市谱标实验器材科技有限公司)观察，用试剂盒提供的阳性病理切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为空白对照。

1.3.2 随访情况：对所有患者进行3年随访，随访截止时间为2019年12月31日，死亡患者以死亡日期作为随访截止时间，随访方式为入户、电话随访，随访内容为患者生存情况、病情变化等。

1.4 结果判定 免疫组化结果采用半定量法进行判定，即通过所取切片的阳性染色深度和阳性细胞所占百分比来共同决定。实验结果分别由3位专业实验人员独立判断评定，根据评分标准描述UBE2C表达水平。判断标准[10]：UBE2C阳性表达为细胞核中出现棕色至棕褐色颗粒，大部分均匀分布在胞核或位于核膜下方，部分呈小斑块不规则分布。阳性染色强度评分：样品无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。在显微镜下，随机选取10个高倍视野(×400)，记录细胞数，按照阳性染色细胞所占百分比评分。评分标准：阳性染色细胞所占比例<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将染色强度评分与阳性染色细胞所占百分比的评分相乘，根据二者乘积大小将免疫组化结果进行等级划分：0～1分记为阴性(-)，2～3分记为弱阳性(+)，4～6分记为阳性(++)，7～9分记为强阳性(+++)。其中阴性和弱阳性记为UBE2C低表达，阳性和强阳性记为UBE2C高表达。

2 结 果

2.1 2组UBE2C表达水平比较 免疫组化检测结果表明，原发性肝癌组织中UBE2C阳性表达率为92.66%(101/109)，显著高于癌旁组织的64.22%(70/109)，差异有统计学意义(χ2=26.067，P=0.000)，见表1。

表1 原发性肝癌组织及癌旁组织中UBE2C表达水平比较 [例(%)]

2.2 UBE2C表达水平在不同原发性肝癌临床病理参数中比较 原发性肝癌组织中UBE2C的表达水平在患者的不同性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在不同TNM分期、淋巴血管间隙浸润、复发中比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 UBE2C表达水平与原发性肝癌临床病理参数相关性分析 UBE2C表达水平与TNM分期、淋巴血管间隙浸润、复发呈正相关(r/P=0.506/0.000、0.517/0.000、0.493/0.002)。

2.4 不同UBE2C表达水平原发性肝癌患者生存率比较 UBE2C高表达原发性肝癌患者中位生存时间为23.32个月，显著短于UBE2C低表达患者的33.32个月(χ2=9.129，P=0.003)， 见图1。

图1 不同UBE2C表达水平原发性肝癌患者生存率比较

2.5 影响原发性肝癌患者预后的危险因素分析 多因素分析结果表明，有淋巴血管间隙浸润、复发及UBE2C高表达的原发性肝癌患者发生不良预后的风险明显高于无淋巴血管间隙浸润、未复发及UBE2C低表达的患者(OR=2.880、2.975、3.475，P均<0.05)， 见表3。

表2 UBE2C表达水平与原发性肝癌临床病理参数的关系 [例(%)]

表3 影响原发性肝癌患者预后的危险因素分析

3 讨 论

全世界每年新增原发性肝癌患者约900万，其中我国约400万，严重威胁人民的身体健康[11]。原发性肝癌患者临床表现为肝部刺痛或持续性钝痛，并伴随腹胀，目前临床上对原发性肝癌主要采用以手术为主，化疗、放疗、分子靶向治疗为辅的策略[12]。原发性肝癌早期临床表现不明显，导致难以及时发现、治疗，因而大多数患者确诊时已处于中晚期，术后预后差[13-14]，因此临床上急需探寻一种分子标志物用于原发性肝癌患者预后判断及靶向治疗，以改善原发性肝癌患者不良预后，提高生存率。

UBE2C类属于人泛素偶联酶家族，通过对细胞质、细胞膜、内质网和细胞核等处蛋白质进行蛋白酶体和泛素化酶调控发挥作用[15-16]。UBE2C能够参与细胞有丝分裂和周期蛋白相关因子的泛素化进程，从而发挥促进细胞有丝分裂的功能，其高表达可诱导胞内功能蛋白质降解，破坏细胞染色体组结构，在肿瘤组织中的异常表达逐渐引起学者们的广泛关注。本研究发现，原发性肝癌组织中UBE2C阳性表达率显著高于癌旁组织，表明UBE2C水平上调可能与原发性肝癌发生有关。Nicolau-Neto等[17]研究发现，食管鳞状细胞癌组织中UBE2C过表达，瘤旁组织中低表达，UBE2C可能通过调控细胞周期蛋白B1水平，影响食管鳞癌细胞增殖和周期，有望成为肿瘤生物标志物候选物。本研究提示，UBE2C也可能通过调控B1等相关蛋白表达影响染色体结构和肝癌细胞周期，进而促进肝癌细胞增殖等，影响肝癌发生。冯力[18]研究表明，UBE2C在神经母细胞瘤组织中阳性表达率显著升高，且与神经母细胞瘤分期、复发相关，提示UBE2C可能在神经母细胞瘤侵袭、转移、复发进程中发挥作用[18]。本研究结果显示，UBE2C在原发性肝癌组织中的表达水平与患者TNM分期、淋巴血管间隙浸润、复发呈正相关，与上述研究结果相似，提示原发性肝癌组织中UBE2C高表达还可能预示肝癌分期升高、转移发生及患者复发风险增加，该过程可能与UBE2C水平升高引起癌细胞周期异常改变有关。

TCGA数据库分析表明，UBE2C在肾透明细胞癌组织中表达水平显著升高，与患者生存期有关[19]。翁鸿等[20]研究发现，膀胱癌变组织中UBE2C基因高表达组患者的预后差于低表达组，提示UBE2C高表达与膀胱癌患者不良预后有关。本研究发现，UBE2C高表达原发性肝癌患者中位生存时间显著短于低表达患者，与上述研究结果一致，提示UBE2C高表达可能与原发性肝癌患者生存时间短等不良预后发生有关，UBE2C可能成为评价原发性肝癌患者预后的临床指标。本研究还通过COX多因素回归分析发现，有淋巴血管间隙浸润、复发及UBE2C高表达的原发性肝癌患者发生不良预后的风险明显高于无淋巴血管间隙浸润、未复发及UBE2C低表达患者，进一步提示UBE2C水平升高可能预示原发性肝癌患者不良预后风险增加，应对UBE2C高表达患者定期检查，以及时发现、治疗，减少不良预后发生。

综上所述，UBE2C在原发性肝癌组织中阳性表达率显著升高，与原发性肝癌患者TNM分期、淋巴血管间隙浸润、复发及生存情况相关，有望成为原发性肝癌预后的检测指标，但是UBE2C参与原发性肝癌发生发展的机制有待进一步探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

董文亮：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；刘洪涛：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；初侃：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；侯铁伟：进行统计学分析；肖遥：课题设计，论文撰写