慢性乙型肝炎患者血清外泌体miR-122、miR-146a表达与HBV-DNA载量的相关性

刘娇，刘青，王大明，贾兴旺，陶淑慧，徐建国

慢性乙型肝炎(CHB)是一种常见传染性疾病，全球约2.4亿人携带乙型肝炎病毒(HBV)，严重威胁人类健康，我国是该病高发区，约占40%[1]。HBV是一种没有明显细胞毒性的嗜肝性双链DNA病毒，其生物活性及复制水平受各种因素影响，HBV感染可导致急性或慢性肝炎，是引起肝纤维化、肝硬化、肝癌的主要因素之一，因此寻找影响乙型肝炎病毒-DNA(HBV-DNA)复制的生物因子有重要意义[2]。研究报道，微小RNA(miRNA)对肝损伤十分敏感，miR-122、miR-146a均是免疫相关性miRNA，可参与细胞免疫应答及炎性反应，miR-122可预测干扰素治疗CHB的疗效，且与HBV-DNA高载量CHB患者肝损伤及预后有关，miR-146a 与肝癌、肝损伤等肝脏疾病密切相关，但目前关于miR-122、miR-146a表达与HBV复制的关系鲜有报道[3-7]。外泌体是一类直径为30～150 nm的小囊泡，研究报道血清外泌体中含有大量HBV-DNA及miRNA等成分，是HBV的一种重要传播介质[8-9]。因此本研究拟通过检测CHB患者血清外泌体miR-122、miR-146a表达水平，分析其与HBV-DNA载量的关系，以期为临床CHB的靶向治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年5月—2019年12月南方医科大学深圳医院肝病中心收治CHB患者285例，根据血清外泌体HBV-DNA载量分为3组，每组95例。低载量组(HBV-DNA<1×105拷贝/ml)男65例，女30例，年龄18～75(49.62±12.59)岁；病程(5.48±1.12)年；有HBV家族史33例；合并症：糖尿病16例，高血压12例。中载量组(1×105拷贝/ml ≤HBV-DNA≤1×107拷贝/ml)男66例，女29例，年龄19～76(50.14±12.97)岁；病程(5.75±1.21)年；有HBV家族史35例；合并症：糖尿病14例，高血压13例。高载量组(HBV-DNA>1×107拷贝/ml)男 67例，女28例，年龄18～75(51.32±12.86)岁；病程(6.73±1.36)年；有HBV家族史34例；合并症：糖尿病15例，高血压14例 。另取同期门诊健康体检者95例为健康对照组，男63例，女32例，年龄18～76(50.95±12.84)岁。4组受试者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，受试者及其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①符合“慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)”[10]中关于CHB的诊断标准；②血清样本采集前患者未接受任何治疗；③临床检测资料完整。(2)排除标准：①合并肝癌或其他肿瘤者；②妊娠或哺乳期妇女；③合并脂肪肝或其他类型肝炎病毒感染者；④心、肺、肾等脏器功能异常或严重病变者。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 血清外泌体检测：(1)外泌体制备，CHB患者于入院次日、体检者于体检当日上午(8：00～10:00)采集空腹外周静脉血10 ml， 离心收集血清，采用血清外泌体提取试剂盒(购自上海歌凡生物科技有限公司)提取血清外泌体，具体步骤严格按照说明书进行。提取物中外泌体采用透射电镜(型号Glacios Cryo，购自美国Thermo公司)观察鉴定。(2)血清外泌体HBV-DNA载量检测，采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测血清外泌体HBV-DNA载量。(3)血清外泌体miR-122、miR-146a水平检测，采取受试者外泌体50 μl，以RNA提取试剂盒(购自上海碧云天有限公司)提取外泌体总RNA，反转录得cDNA置于-20℃保存备用(反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司)。采用RT-qPCR仪(型号7500，购自美国Bio-Rad公司)对miR-122、miR-146a进行扩增。反应体系共25 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1μl，ddH2O 8.5 μl(PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司)。反应条件为：95℃、5 s，95℃、30s，60℃、30s，72℃、15s，40个循环；添加溶解曲线。引物由上海吉玛生物科技有限公司合成，miR-122上游引物序列为：5′-CCCGTGATGCTTCTTTTCTC-3′，下游引物序列为：5′-ATGTGAGAGGCAGGGTTC AG-3′；miR-146a上游引物序列为：5′-CATGGGTTGTCTCAGTGTCAGAGC T-3′，下游引物序列为：5′-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3′；内参U6上游引物序列为：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列为：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△△CT法对血清外泌体miR-122、miR-146a相对表达水平进行定量分析。

1.3.2 血清肝纤维化指标检测：上述血清采用化学发光法检测透明质酸酶(HA,试剂盒购自郑州安图生物工程股份有限公司)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ，试剂盒购自上海彩佑生物科技有限公司)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ，试剂盒购自南京莱富赛生物科技有限公司)、层黏连蛋白(LN，试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司)，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 各组血清外泌体HBV-DNA 载量及miR-122、miR-146a表达水平比较 与健康对照组比较，低、中、高载量组血清外泌体HBV-DNA 载量及miR-122水平依次增加，miR-146a表达水平均依次降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.2 各组血清肝纤维化指标水平比较 与健康对照组比较，低、中、高载量组血清肝纤维化指标HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均依次增加，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3 CHB患者血清外泌体miR-122、miR-146a表达水平及HBV-DNA 载量的相关性 血清外泌体miR-122与miR-146a水平呈负相关(r=-0.765，P=0.000)，与HBV-DNA 载量呈正相关(r=0.773，P=0.000)；miR-146a与HBV-DNA 载量呈负相关(r=-0.840，P=0.000)。

2.4 CHB患者血清外泌体miR-122、miR-146a表达水平与肝纤维化指标的相关性 血清外泌体miR-122水平与HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈正相关(r=0.764、0.699、0.665、0.697，P均<0.01)，miR-146a水平与HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈负相关(r= -0.779、-0.731、-0.691、-0.738，P均<0.01)。

3 讨 论

外泌体广泛存在于血清、尿液、乳汁等多种细胞液中，其内容物包括特性蛋白、脂质、DNA、mRNA及miRNA等多种分子，可参与细胞信号传导、物质传递、血管生成、炎性反应及免疫调节等生理病理过程。与游离性miRNA相比，外泌体源性miRNA稳定性及抗降解能力更强，在CHB及肝细胞癌诊断及靶向治疗中意义重大[11-14]。因此本研究以血清外泌体为研究材料进行试验。

表1 4组受试者血清外泌体HBV-DNA 载量及miR-122、miR-146a表达水平比较

表2 4组受试者血清肝纤维化指标水平比较

研究报道， miR-122与CHB密切相关，是一种肝损伤标志性miRNA[15]。王福玲[16]研究报道，血清miR-122水平随HBV-DNA载量增加而升高，与HBV-DNA载量呈正相关。Mosedale等[17]研究报道，外泌体miR-122水平在药物性肝损伤细胞中显著增加，与细胞程序性死亡及细胞膜通透性增加有关。Jiao等[18]研究报道，持续病毒应答组血清和外泌体miR-122-5p水平均显著高于无应答组，miR-122-5p可作为丙型病毒性肝炎诊疗的生物标志。本研究结果发现，与健康对照组比较，HBV-DNA低、中、高载量组血清外泌体miR-122表达水平随HBV-DNA载量增加而增加，且与肝纤维化指标HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈正相关。HA是一种广泛存在于细胞外基质中的高糖分子，主要在肝内皮细胞中降解，肝脏组织受损时，对HA降解能力下降，导致血清HA水平增加。PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN是肝硬化早期指标，可反映肝纤维化程度。提示血清外泌体miR-122水平增加可能与CHB患者HBV-DNA复制及肝纤维化有关，影响CHB发生发展。

miR-146a与多种慢性炎性疾病有关，可参与天然免疫和获得性免疫过程，在肝脏疾病中亦发挥重要作用[7, 19]。马宏丰等[20]研究报道，miR-146a在原发性肝癌组织及HepG2细胞中均显著下调，过表达miR-146a可降低HepG2细胞增殖，抑制其迁移及侵袭。周兴宏等[21]研究报道，三七皂苷R1可通过上调miR-146a水平减轻ApoE-/-小鼠血糖血脂水平，保护小鼠肝脏炎性反应损伤。本结果发现，血清外泌体miR-146a表达水平随HBV-DNA载量增加而降低，与miR-122、HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈负相关，提示CHB患者血清外泌体miR-146a可能对miR-122起拮抗作用，影响HBV-DNA复制及肝纤维化进程，血清外泌体miR-122、miR-146a水平有望成为CHB患者靶向治疗的新型标志物。

综上所述，CHB患者血清外泌体miR-122随HBV-DNA 载量增加而升高，miR-146a水平呈相反趋势，二者可能拮抗影响HBV-DNA 复制及肝纤维化程度。关于miR-122、miR-146a参与CHB发生发展的具体炎性反应相关通路尚不完全清楚，有待加大样本量进一步深入探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘娇：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；刘青：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；王大明：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；贾兴旺：进行统计学分析；陶淑慧、徐建国：课题设计，论文撰写