IL-23/IL-17炎性反应轴与HBV宫内感染的相关性研究

王兰芳，高智莲，葛晓伟，张倩，张静，吴秀梅，陈先侠

乙型肝炎病毒(HBV)母婴垂直传播是其高致病及婴幼儿慢性感染的主要原因，宫内感染HBV易成为慢性携带者，且具有发展为肝硬化、肝癌的高风险[1]。目前关于宫内感染的发生发展机制尚未十分清楚，以往报道表明，辅助性T细胞17(Th17)具有促炎作用，调节性T细胞(Treg)具有抑制炎性反应的作用，Treg/Th17平衡可调节机体的免疫反应，且与多种疾病的发生发展相关[2]。近年研究发现，白介素-23(IL-23)/IL-17炎性反应轴在多种疾病的发生发展过程中可能具有重要作用[3]。Th17细胞能够分泌具有较强致炎作用的IL-17，IL-17具有促进炎性因子和趋化因子产生，以及趋化中性粒细胞聚集的作用[4]。研究表明，IL-17在自身免疫性疾病中也具有重要作用[5]。促炎因子IL-23主要由树突状细胞分泌，其能够诱导Th17细胞的增殖及IL-17的分泌，在体内发挥致炎作用[6]。IL-23/IL-17炎性反应轴在自身免疫性疾病中发挥重要作用，但关于IL-23/IL-17炎性反应轴在HBV宫内感染的研究鲜有报道。现分析IL-23、IL-17与相关因子IL-6、干扰素-γ(IFN-γ)的关系及两者在HBV宫内感染中的作用，为相关疾病的治疗提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年8月—2019年9月安徽省妇幼保健院/安徽医科大学附属妇幼保健院产科住院分娩的HBsAg阳性孕妇120例为研究组，年龄20～40(28.25±2.58)岁，胎龄37～41(38.49±1.30)周。根据新生儿脐带血乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)检测结果分为2个亚组，HBV-DNA阳性者为宫内感染亚组(n=18)，HBV-DNA阴性者为宫内未感染亚组(n=102)。选择同期来院体检的健康孕妇120例为健康对照组，年龄21～40(28.42±2.34)岁，胎龄37～41(38.27±1.09)周。2组孕妇均为单胎妊娠，年龄、胎龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，全部孕妇及其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①孕妇血清检测HBsAg阳性；②孕期无其他产科合并症及并发症；③肝肾功能正常。(2)排除标准：①患有先天性免疫疾病者；②近期服用抗病毒药物、皮质激素类药物；③胎儿畸形者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 样本采集：采集孕妇分娩前外周静脉血及新生儿脐带血各2管(共4管，每管3 ml)，母儿血液各一管于24 h内检测Treg和Th17细胞；孕妇另一管血液于室温静置30 min，离心得血清分装于无菌EP管中，-20℃冻存备用；新生儿脐带血另一管用来检测HBV-DNA。新生儿脐带血采集前首先用生理盐水擦拭脐带，然后用酒精擦拭，以防止脐带血污染。

1.3.2 IL-23/IL-17炎性反应轴相关指标测定：(1)孕妇血Treg和Th17细胞测定，采用FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪(美国BD公司)检测，操作步骤严格按照说明书进行，计算Treg、Th17细胞占CD4+T细胞比率。(2)孕妇及新生儿脐带血清细胞因子检测，以酶联免疫吸附(ELISA)法检测孕妇及新生儿脐带血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平，ELISA试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司，检测步骤按照说明书进行。

1.3.3 新生儿脐带血HBV-DNA检测：采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测新生儿脐带血HBV-DNA水平，使用Trizol试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)提取总RNA，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒(日本TakaRa公司)将RNA反转录为cDNA，运用DNASTAR软件设计引物，PCR反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性5 s，57℃退火20 s，57℃延伸20 s，共进行35个循环。所有操作均按照试剂盒说明书进行，HBV-DNA水平≥1×103拷贝/ml则判定为宫内感染。

2 结 果

2.1 2组宫内感染比较 经RT-PCR检测新生儿脐带血HBV-DNA发现，研究组孕妇分娩的新生儿发生宫内感染18例(15.0%)，健康对照组无新生儿发生宫内感染，研究组宫内感染率显著高于健康对照组(χ2=19.459，P=0.000)。

2.2 各组血Treg和Th17细胞水平比较 2亚组孕妇血Treg细胞和Th17细胞比率均显著高于健康对照组(P<0.05)，且宫内感染亚组上述指标均高于宫内未感染亚组(P<0.05)，见表1。

表1 各组孕妇血Treg细胞和Th17细胞水平比较

2.3 各组孕妇血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比较 与健康对照组比较，宫内未感染亚组孕妇血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平差异无统计学意义(P>0.05)，而宫内感染亚组孕妇血清IL-17、IL-23、IL-6水平显著升高，血清IFN-γ水平显著降低(P<0.05)，见表2。

2.4 新生儿脐带血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比较 各组新生儿脐带血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5 IL-23/IL-17炎性反应轴与Treg、Th17细胞相关性分析 孕妇血清IL-23、IL-17、IL-6、Treg细胞及Th17细胞各因子间均呈显著正相关，与IFN-γ均呈显著负相关(P均<0.05)，见表4。

2.6 血清IL-17、IL-23诊断HBV宫内感染ROC分析 ROC结果显示，孕妇血清IL-17、IL-23联合诊断HBV宫内感染的价值明显优于单项诊断，见表5、图1。

表2 各组孕妇血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比较

表3 各组新生儿脐带血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比较

表4 IL-23/IL-17炎性反应轴与Treg、Th17细胞相关性分析

图1 孕妇血清IL-17、IL-23对HBV宫内感染的诊断价值ROC曲线分析

3 讨 论

HBV宫内感染是指孕妇感染HBV后通过胎盘感染腹中胎儿，又称之为母婴传播或先天感染。宫内感染途径从时间上主要分为产前、产时、产后，分娩时感染HBV主要是宫颈分泌物及产妇的血液[7-8]。目前对于产时、产后HBV感染可以使用乙肝疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)阻断，对于产前感染的治疗方法则较难实施。温海秀等[9]研究表明，母亲HBeAg阳性新生儿HBV宫内传播率为18.52%，阴性则为6.59%。邵昱璋等[10]研究表明，新生儿宫内感染率与母体胎盘及血清中HBV-DNA水平有密切联系，宫内感染儿童其母体HBV-DNA水平均高于105拷贝/ml。本研究中，新生儿HBV-DNA检测发现，宫内感染率为15.0%，低于上述研究结果，可能与选择的对象及研究样本量不同有关，但是上述结果均说明HBV宫内感染率仍很高，而宫内感染是导致母婴阻断失败的重要原因，对新生儿影响极大，因此及时探索影响宫内感染的相关机制并采取有效措施预防宫内感染极为重要。

IL-23主要由树突状细胞和巨噬细胞分泌，具有促进细胞因子、炎性反应因子、趋化因子产生的作用，能够激活并调节T细胞诱导的慢性炎性反应及自身免疫反应[11]。Th17细胞主要由幼稚CD4+T细胞分化而来，IL-23作为CD4+T细胞分化为Th17细胞不可缺少的细胞因子，能够诱导激活CD4+T细胞的增殖与分化，刺激IL-17/IL-17F的分泌，加强IL-23/IL-17炎性反应轴诱导的炎性反应性疾病[12-13]。IL-17/IL-17F与受体结合后促进IL-6的表达，趋化中性粒细胞聚集到炎性反应部位[14]。Treg细胞在IL-23的作用下可转变为具有分泌IL-17功能的细胞，促进IL-17分泌增多。本研究显示，宫内未感染亚组及宫内感染亚组Treg细胞和Th17细胞占CD4+T细胞的比例均显著高于健康对照组，宫内感染亚组孕妇血Treg细胞和Th17细胞占CD4+T细胞的比例高于宫内未感染亚组，与以往研究结果一致，说明HBV宫内感染的孕妇体内存在免疫功能失调的现象，而Treg/Th17失衡可能是引起HBV宫内感染的重要免疫机制之一。

IL-23/IL-17参与体内多种炎性反应、自身免疫疾病的调节及妊娠期疾病的发展，IL-23/IL-17炎性反应轴与Th17细胞的活化和维持密切相关，在多种炎性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠病、哮喘中具有重要作用，并影响HBV宫内感染过程[15]。Th17细胞参与炎性反应，促进肝脏的炎性反应损伤。贾冠华等[16]研究结果显示，慢性乙型病毒性肝炎患者血清中IL-23表达量随病情严重程度而上升。HBx蛋白诱导NF-κB的活化，进而通过Erk-p65/p50信号转导通路诱导IL-23的分泌，IL-23能够刺激HBV感染患者肝脏及外周血中Th17细胞分泌IL-17[17]。王琳等[18]研究结果显示，HBV感染患者IL-23主要来源于髓样树突状细胞和巨噬细胞，且IL-23/IL-23R轴调节IL-17的分泌。IFN-γ主要由Th1型细胞分泌，在HBV的清除中发挥重要作用。本研究结果显示，宫内感染亚组血清IL-17、IL-23、IL-6水平高于健康对照组和宫内未感染亚组，IFN-γ水平低于健康对照组和宫内未感染亚组，同时ROC曲线分析孕妇血清IL-17、IL-23预测HBV宫内感染的AUC分别为0.791、0.693，截断值为264.77 ng/L、227.99 ng/L，表明血清IL-17高于264.77 ng/L，IL-23高于227.99 ng/L时可能有HBV宫内感染，且IL-17、IL-23联合诊断价值更高，其AUC为0.803，表明两者联合可提高临床诊断价值，同时也说明HBV感染后炎性因子IL-23分泌增多，促进Th17细胞的分化进而促进IL-17的分泌，IL-17又促进炎性因子IL-6的分泌，因此推测IL-23/IL-17炎性轴在HBV宫内感染中发挥重要作用，但是关于此途径是否和其他细胞因子或信号转导途径共同参与HBV宫内感染的发生，还有待进一步更深层次分析。

表5 孕妇血清IL-17、IL-23对HBV宫内感染的诊断价值分析

还有研究证实，胎儿及新生儿免疫系统发育不完善，免疫功能不成熟，早期体液及细胞免疫水平较低，细胞因子IL-17、IL-6、IFN-γ分泌水平更低[19-21]。本研究结果显示，健康对照组和研究组新生儿脐带血清中IL-23、IL-17、IL-6、IFN-γ比较差异无统计学意义，且均低于母体相应因子水平，表明新生儿免疫功能不完善，Th细胞功能低下，各种细胞因子的产生能力也较低，存在多种炎性反应因子及细胞因子的缺陷，故患儿不能及时有效地清除体内的HBV病毒，因此，对HBV宫内感染的预防应重点放在孕妇身上，减少孕妇的体内病毒量。

综上所述，IL-23/IL-17炎性反应轴与HBV宫内感染密切相关，IL-23与IL-17呈显著正相关，且二者均可作为孕妇HBV宫内感染的临床检测指标。但本研究由于样本数量较少，未对远期治疗效果进行随访，存在不足之处，今后将扩大样本数量进行深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

王兰芳：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；高智莲：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；葛晓伟、张倩：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；张静、吴秀梅：进行统计学分析；陈先侠：课题设计，论文撰写