布氏杆菌感染者血清Tim-3/HMGB1与相关细胞因子的变化

2020-10-20杨丽玮卢佩佩西丽娜依买买提郭淑丽

疑难病杂志 2020年10期

杨丽玮，卢佩佩，西丽娜依·买买提，郭淑丽

布氏杆菌病是由布氏杆菌感染引起的人畜共患传染病，其主要通过消化道、皮肤裂隙、疤痕及吸入的粉尘感染人体，引起多系统、多器官损害[1]。免疫受体T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3(Tim-3)在T细胞介导的免疫应答和细胞凋亡中发挥重要作用，在机体慢性病毒感染、肿瘤免疫逃逸中扮演关键的角色[2]。而高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种非组蛋白，位于细胞核中，由濒死细胞、癌细胞和免疫细胞分泌，是Tim-3的配体，在布氏杆菌感染者细胞表面上高表达的免疫受体Tim-3，诱导机体产生多种细胞因子、趋化因子和活性氧等，进而导致炎性反应或细胞组织损伤[3]。然而，目前尚未阐明Tim-3/HMGB1在布氏杆菌感染者中的表达变化，以及其与相关细胞因子水平变化的关系，基于此，分析布氏杆菌感染者体内Tim-3/HMGB1与相关细胞因子的变化，为布鲁氏感染者治疗提供新的靶点，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2017年10月—2018年10月于新疆维吾尔自治区人民医院感染科住院布氏杆菌感染者32例作为布病组，男21例，女11例，年龄22～62(37.45±7.22)岁；病程3～10(4.76±2.15)个月；有明确接触史25例(78.12 %)，其中屠宰工作人员4例，养殖人员14例，疾控人员7例；临床分期：急性期25例，慢性期7例；既往治疗史14例；合并症：睾丸炎18例，卵巢炎9例，心、肾及神经系统受累表现者5例。同时选取同期于医院体检的正常人30例作为健康对照组，男19例，女11例，年龄22～65(38.27±6.87)岁；2组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。均衡可比。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①均符合布氏杆菌病诊疗指南(试行)与布氏杆菌病诊断标准(WS 269—2019)[4-5]；②均追踪随访检测2个月以上。(2)排除标准：①结核、败血症、伤寒、副伤寒、风湿热等疾病者；②资料不完整者；③中途退出者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及干细胞因子(SCF)水平的检测：采集2组研究对象的外周血清3 ml，置于-80 ℃冰箱中备用。使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产的热电MK3酶标仪，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及SCF水平。检测操作严格按照赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供的试剂盒说明书进行。

1.3.2 TGF-β水平检测：采用酶联免疫斑点法检测研究对象的外周血单个核细胞(PBMC)中TGF-β的斑点形成细胞数(SFC)。采抗凝血3 h内分离PBMC，在包被特异性抗人TGF-β抗体的96孔酶联免疫斑点板，每孔加入100 μl培养液调至终浓度为2×105个PBMC。每份PBMC样本加3个孔，磷酸缓冲盐溶液(PBS)100 μl为阴性对照孔，终浓度为5 μg/ml植物血凝素(PHA)为阳性对照孔，终浓度为5 μg/ml布氏杆菌重组蛋白抗原(BCSP31)为实验刺激孔，置37 ℃、5%含量的CO2培养箱培养24 h。酶联免疫斑点板置于德国BIOSYS公司提供的YZ-2000 C 型酶联斑点分析仪，调参数，计数。

2 结果

2.1 2组血清Tim-3、HMGB1水平比较布病组Tim-3、HMGB1水平高于健康对照组(P<0.01)，见表1。

表1 2组受试者血清Tim-3、HMGB1水平比较

2.2 2组血清TNF-α、IL-1β及SCF水平比较布病组血清TNF-α、IL-1β及SCF水平均高于健康对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组受试者血清TNF-α、IL-1β及SCF水平比较

2.3 2组PBMC中分泌TGF-β的SFC比较布病组中采用BCSP31为实验刺激孔TGF-β的SFC明显多于健康对照组，而2组中阴性与阳性对照孔TGF-β的SFC比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图1、图2。

3 讨论

布氏杆菌侵入机体后被吞噬细胞吞噬，逐步形成感染灶、菌血症，随后入侵人体重要脏器而大量繁殖，导致临床表现为波浪热，伴随关节痛和全身乏力等症状[1]。Tim-3蛋白作为促炎性刺激参与靶细胞的信号传导，在炎性反应中发挥重要的作用。HMGB1是一种非组蛋白，位于细胞核内，与DNA结合以促进核转录过程。此外，转化生长因子-β(TGF-β)在炎性反应、组织修复和胚胎发育等方面的生物学功能进行研究发现，TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能也有重要的调节作用[6]。而HMGB1会触发布氏杆菌病患者释放TNF-α，进而诱导白细胞产生白介素1β(IL-1β)，导致IL-1β诱导感受态细胞分泌SCF[7]。

表3 2组受试者PBMC中分泌TGF-β的SFC比较

注：与健康对照组比较，a P<0.01

此外，最近发现HMGB1在响应内源性和/或外源性刺激(例如缺氧、内毒素等)情况下产生异常的蛋白质，可能被免疫系统识破,容易发生细胞死亡，濒死/受伤的细胞被动释放或由免疫/癌细胞分泌时起损伤相关分子模式的作用[8]。此过程之后，HMGB1参与触发靶细胞中的信号传导事件。因此，其可作为受应激源影响的细胞分泌的因子[9]。研究发现，在急性髓细胞性白血病期间，HMGB1水平显著升高[10]。最近的证据表明，HMGB1与免疫受体Tim-3可能在重度颅脑损伤、NK细胞上的表达增加[11-12]。由Tim-3触发的信号传导途径影响TNF-α等炎性细胞因子，与宿主免疫防御和造血的控制有关[13-14]。本研究结果显示，布氏杆菌感染者血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及SCF水平上升，这提示以上指标水平高低与布氏杆菌感染情况存在一定的联系。

TGF-β可以通过调节细胞因子、分子及其各自受体表达的间接机制来影响细胞分化[15]。这些反应强烈影响一系列细胞类型的生长和表型。TGF-β活性过高或降低可能分别导致纤维化疾病和过度增殖性疾病[16]。本研究显示，PBMC中分泌TGF-β的SFC显著较高，间接提示布氏杆菌感染者存在受体表达的免疫应答调控机制。蛋白质复合物的形成伴随着α-螺旋含量的增加，而β-链的损失可能主要来自Tim-3蛋白。生物学测试表明，以HMGB1依赖性方式从布氏杆菌感染者细胞释放的TNF-α能够诱导原代人健康白细胞分泌IL-1β。与本研究的观察结果相符，后者表明响应HMGB1刺激的TNF-α和IL-1β分泌均上调[17]。该反应是布氏杆菌感染者进展中非常重要的一步，因为IL-1β与Ⅰ型IL-1受体相互作用，并诱导布氏杆菌感染者细胞增殖所需的SCF产生和分泌[18]。布氏杆菌感染者细胞表达可识别SCF的Kit受体，但由于AML细胞能够诱导健康细胞产生SCF，因此这种造血因子具有高度致癌性，在原代小鼠骨髓细胞中看到了相同的效果。当暴露于HMGB1时，TNF-α、IL-1β和SCF的水平升高，表明HMGB1也可以在骨髓中诱导这种作用[1]。这与本结果显示布氏杆菌感染者Tim-3、HMGB1水平较高，同时TNF-α、IL-1β及SCF水平上升一致。因此， HMGB1作为Tim-3和其他免疫受体的配体对布氏杆菌感染者进展至关重要。

综上所述，布氏杆菌病患者血清Tim-3/HMGB1均增加，且在布氏杆菌抗原刺激后形成TGF-β的斑点形成细胞数明显增加，这可能导致布氏杆菌感染过程免疫应答提升，不利于机体对布氏杆菌的有效清除。