竹节香附素A通过ULK1/Atg13及ROS途径调控肝癌细胞自噬的作用研究

赵利，马向明，王瑛，吉瑞更，付庆江，曹立瀛

肝癌在全球癌症相关死亡中排名第二，早期肝癌患者及时诊断预后良好，5年生存率> 70%，若肝癌进入晚期， 5年生存率<16%[1-3]。自噬是一种细胞内降解途径，是一种复杂的分解代谢过程，涉及长寿命蛋白质的循环和分解，以及细胞内无用细胞器的降解。作为细胞稳态的重要调节剂，自噬与肿瘤细胞的存活相关[4-5]。越来越多的证据表明，在各种抗癌药诱导的细胞死亡过程中，细胞凋亡和自噬之间存在复杂的功能关系。竹节香附素A具有抗炎、抗肿瘤和抗菌能力，其通过诱导癌细胞凋亡实现治疗作用[6-7]。在MCF-7乳腺癌细胞中，竹节香附素A诱导自噬，通过降低耐药性来杀伤癌细胞。活性氧(ROS)是自噬相关的上游细胞因子，可诱导自噬激活激酶1 (ULK1)/自噬相关蛋白13(Atg13)过表达进而激活自噬通路[8]。本研究拟探讨竹节香附素A通过ULK1/Atg13及ROS途径调控肝癌细胞自噬的作用，为肝癌的治疗提供理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验细胞：肝癌HepG2细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，批号18091603。(2)试药试剂： L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；竹节香附素A购自上海安谱实验科技股份有限公司；5氟尿嘧啶、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、吖啶橙染色试剂盒购自美国sigma公司；HEPES缓冲液、裂解缓冲液、BCA蛋白法含量测试盒、5%牛血清白蛋白(BSA)、ECL化学发光检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自美国NEB公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自日本Takara公司；PVDF膜购自北京明阳科华生物科技有限公司；ULK1、Atg13、β-actin一抗购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记IgG二抗购自美国Abcam公司；2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。(3)仪器：MK-9型酶标仪购自美国伯乐公司；Olympus CKX31型荧光显微镜购自日本Olympus公司；XC-987型流式细胞仪购自美国BD公司；QuantStudio5型实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；LAS3000型显影仪购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 肝癌HepG2细胞培养及分组 2019年8—9月于开滦总医院实验室进行实验。肝癌HepG2细胞接种于DMEM培养基， 在37℃、5%CO2的正常培养环境中培养。分组：肝癌HepG2细胞组、5-氟尿嘧啶组、竹节香附素A低剂量组、竹节香附素A高剂量组，在细胞培养过程中干预组分别加入5氟尿嘧啶(浓度为80 mg/μl，预试验求出5氟尿嘧啶的LC50为160 μg/ml，以1/2 LC50为作用剂量)、不同剂量的竹节香附素A，竹节香附素A低、高剂量分别为100、200 mg/μl。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 细胞增殖水平测定：将肝癌HepG2细胞以2×104个/孔的密度接种到96孔板中，与无血清培养基孵育4 h，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞存活率，在酶标仪450 nm波长处读取吸光度值(OD值)。细胞存活率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

1.3.2 细胞自噬检测：通过吖啶橙染色观察自噬情况。将HepG2细胞(6×105个/孔)接种到18 mm×18 mm盖玻片的6孔培养板中，并用磷酸缓冲液4 μl处理72 h，然后冲洗并用吖啶橙(10 mg/L)在37℃染色持续30 min，盖上盖玻片后，使用荧光显微镜观察样品，以评估从绿色到红色的颜色变化。细胞质内出现酸性自噬小体(红色)，说明细胞发生自噬，为阳性细胞；细胞质内出现绿色荧光，说明细胞未发生自噬，为阴性细胞。于高倍镜下随机计数1 000个细胞，并计数自噬小体个数。

1.3.3 肝癌HepG2细胞凋亡检测：各组肝癌HepG2细胞培养结束后，收获细胞，磷酸盐缓冲液洗涤1次并离心，使用膜联蛋白V/PI双染色的流式细胞术分析细胞凋亡。将全细胞收集在HEPES缓冲液(pH 7.4的10 mmol/L HEPES，140 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2)中，随后，用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)(2.5 μg/ml)和PI(2 ng/ml)染色细胞20 min，然后在流式细胞仪上进行分析，使用Cell Quest软件分析凋亡水平，早期凋亡(膜联蛋白V+/PI-)和晚期凋亡(膜联蛋白V+/PI+)的总和为总细胞凋亡。

1.3.4 细胞ULK1、Atg13 mRNA水平测定： TRIzol试剂分离肝癌HepG2细胞总RNA，使用ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录RNA，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行定量PCR分析，制备20 μl反应体系，在实时荧光定量PCR仪中进行反应，将靶基因的表达标准化为β-actin。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列：ULK1正向5'-CGGTAGTTTGCCGTGAGTGA-3'，反向5'-CCGTGACGCTCCCGTGGATG-3'；Atg13正向5'-CCGTGTGATTGGCTTCCGCCGTGAC-3'，反向5'-CCTGTGTGACTCCCTGCCGTGGAGT-3'；β-actin正向5'-CCAGGAAAAGGTGTGAAATC-3'，反向5'-AAGCGCTTGGTGGTCAGATT-3'。反应条件：95℃ 15 s，95℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 35 s，并扩增40个循环。并使用2-△△Ct方法确定ULK1、Atg13 mRNA的相对表达量。

1.3.5 细胞ULK1、Atg13蛋白水平测定：收集肝癌HepG2细胞，将所有细胞在冰上用裂解缓冲液裂解30 min，并将细胞碎片在4℃下离心，通过BCA蛋白法含量测试盒检测蛋白质浓度。使用二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质在12V电压下分离，而后将其印迹到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂干乳液在5%牛血清白蛋白封闭膜2 h。将PVDF膜与ULK1、Atg13、β-actin一抗(稀释比1∶1 000)在4℃下孵育24 h，在BSA中洗涤PVDF膜3次，持续10 min，在37℃下将辣根过氧化物酶标记IgG二抗(稀释比1∶2 000)孵育1 h，在BSA中洗涤PVDF膜3次，持续10 min。使用化学发光ECL测定试剂盒检测各蛋白质，使用LAS3000型显影仪显示Western印迹，通过MultigaugeV3.0软件应用图像分析检测蛋白质表达。

1.3.6 ROS检测：ROS水平通过2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Beyotime)测量。让96孔板上的肝癌HepG2细胞附着过夜，然后用相应药物处理24 h，除去培养基，用PBS洗涤3次，然后与DCFH-DA在37℃下温育30 min，通过酶标仪测量488 nm激发波长和525 nm发射波长的ROS水平。

2 结 果

2.1 各组肝癌HepG2细胞OD值、存活率比较 与肝癌HepG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组细胞OD值、存活率降低(t/P=15.639/0.000、21.547/0.000、18.541/0.000、26.324/0.000、18.514/0.000、16.852/0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞OD值、存活率升高(t/P=21.214/0.000、19.547/0.000、18.547/0.000、25.478/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组细胞OD值、存活率降低(t/P=16.547/0.000、23.547/0.000)，见表1。

表1 各组肝癌HepG2细胞OD值、存活率比较

2.2 各组肝癌HepG2细胞自噬小体水平比较 与肝癌HepG2细胞组(63.54±12.54个)比较，5-氟尿嘧啶组(598.54±15.64个)、竹节香附素A低剂量组(290.47±17.54个)、高剂量组(483.65±15.69个)自噬小体数升高(t/P=10.547/0.000、16.547/0.000、20.547/0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组自噬小体数降低(t/P=16.325/0.000、22.547/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组自噬小体数升高(t/P=15.696/0.000)，见图1。

2.3 肝癌HepG2细胞凋亡率比较 与肝癌HepG2细胞组细胞凋亡率(0.90±0.24)%比较，5-氟尿嘧啶组(10.80±0.26)%、竹节香附素A低剂量组(2.30±0.23)%、高剂量组(9.00±0.29)%升高(t/P=12.321/0.000、25.547/0.000、19.541/0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞凋亡率降低(t/P=9.874/0.000、16.589/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组细胞凋亡率升高(t/P=10.654/0.000)，见图2。

2.4 各组肝癌HepG2细胞ULK1、Atg13 mRNA表达水平比较 与肝癌HepG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组细胞ULK1、Atg13 mRNA表达水平升高(t/P=25.654/0.000、15.987/0.000、23.547/0.000、18.654/0.000、18.547/0.000、16.547/0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞ULK1、Atg13 mRNA表达水平降低(t/P=13.654/0.000、14.654/0.000、16.589/0.000、21.247/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组细胞ULK1、Atg13 mRNA表达水平升高(t/P=14.697/0.000、18.324/0.000)，见表2。

表2 各组肝癌HepG2细胞ULK1、Atg13 mRNA表达水平比较

2.5 各组肝癌HepG2细胞ULK1、Atg13蛋白表达水平比较 与肝癌HepG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组细胞ULK1、Atg13蛋白表达水平升高(t/P=18.741/0.000、16.547/0.000、17.548/0.000、16.547/0.000、15.847/0.000、20.478/

0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞ULK1、Atg13 蛋白表达水平降低(t/P=21.687/0.000、18.324/0.000、18.541/0.000、19.587/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组细胞ULK1、Atg13 蛋白表达水平升高(t/P=17.024/0.000、19.634/0.000)，见表3、图3。

表3 各组肝癌HepG2细胞ULK1、Atg13 蛋白表达水平比较分)

注：A.肝癌HepG2细胞组；B.5-氟尿嘧啶组；C.竹节香附素A低剂量组；D.竹节香附素A高剂量组

肝癌HepG2细胞组 5-氟尿嘧啶组 竹节香附素A低剂量组 竹节香附素A高剂量组

肝癌HepG2细胞组 5-氟尿嘧啶组 竹节香附素A低剂量组 竹节香附素A高剂量组

2.6 各组肝癌HepG2细胞ROS水平比较 与肝癌HepG2细胞组ROS水平(51.08±1.13)mol/ml比较，5-氟尿嘧啶组(59.89±1.23)mol/ml、竹节香附素A低剂量组(54.14±1.27)mol/ml、高剂量组(56.56±1.36)mol/ml升高(t/P=13.254/0.000、18.524/0.000、16.254/0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组ROS水平降低(t/P=19.654/0.000、24.052/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组ROS水平升高(t/P=18.547/0.000)。

3 讨 论

竹节香附素A具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性。研究表明，竹节香附素A是Bcl-2蛋白表达的有效抑制剂，是各种肿瘤中抗凋亡蛋白的抑制剂[9]。竹节香附素A在多种癌细胞系中诱导细胞凋亡。在人类肺癌细胞中，竹节香附素A可以抑制癌细胞迁移和入侵。竹节香附素A还可抑制炎性因子核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)，而肿瘤血管生成与炎性反应密切相关；竹节香附素A也可抑制肿瘤血管生成[10]。这些结果表明，竹节香附素A可能具有抗肿瘤治疗的潜力。本研究发现，与肝癌HepG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组OD值、存活率降低，细胞自噬小体、凋亡率水平升高。这提示竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞自噬及凋亡。细胞凋亡和自噬是程序性细胞死亡的2种重要类型。细胞凋亡被认为是杀死肿瘤细胞的主要分子机制，其有2种信号通路，包括外源和内源通路[11-14]。内在凋亡途径，也称为线粒体启动途径，与细胞色素C(Cyto-C)释放到细胞质有关，后者激活下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，包括Atg13，最终导致细胞凋亡。研究已发现[15]，在胃癌细胞中，竹节香附素A通过激活Caspase信号通路诱导胃癌细胞凋亡，这与本研究结果一致。

自噬是将细胞质材料递送至溶酶体以降解的过程。超过30个基因参与自噬，其称为Atg。Atg13是雷帕霉素(TOR)激酶信号通路的靶点，通过Atg13和ULK1的磷酸化及ULK1/Atg13复合物的调节来影响自噬[16-19]。此外，近年来越来越多的证据表明，ULK1具有抗增殖活性。当ULK1用作肿瘤抑制因子表达时，它主要定位于细胞质；当ULK1抑制上皮向间质转化时，它会转导到细胞核中[20]。数据表明，ULK1通过抑制增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白来抑制食管组织细胞核中的增殖。此外，ULK1通过p53依赖性途径在肾上皮细胞(HEK293)、人肝细胞癌细胞(HepG2)和人乳腺癌(MDA-MB-231、MCF-73)中显示出显著的抗增殖作用[21-22]。在体外细胞研究中，CCK-8和细胞克隆形成试验表明，过表达ULK1可以有效抑制A549和H1299肺癌细胞的增殖。Atg13是肿瘤抑制器和细胞能量状态的传感器，在增殖和自噬中起重要作用。Atg13可以被肝激酶B1、钙依赖性蛋白激酶β及一些小分子磷酸化和激活。活化的Atg13与肿瘤的生长、侵袭和迁移密切相关。因此，Atg13是一种正调节剂，可响应能量消耗刺激自噬。最近的研究表明，Atg13通过磷酸化和激活ULK1直接调节自噬。本研究结果表明，激活肝癌HepG2细胞中的Atg13，可抑制肝癌细胞的增殖。ULK1/Atg13复合物在ROS的调节和功能中起作用。ROS通过Atg13磷酸化自噬相关激酶ULK1来调节自噬。有证据表明ROS在自噬诱导中响应各种细胞应激(包括葡萄糖饥饿)的作用[23]。ULK1是肿瘤抑制因子和细胞能量状态的传感器，它在增殖和自噬中起重要作用，ULK1可被肝激酶B1，钙依赖性蛋白激酶-β和一些小分子磷酸化和激活，活化的ULK1与癌细胞的肿瘤生长，侵袭和迁移密切相关[24-26]。因此，ULK1是一种正能调节因子，可以响应能量消耗而刺激自噬。最近的研究表明，ULK1通过磷酸化和激活BAX直接调节自噬。本结果显示，与肝癌HepG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达水平、ROS水平升高。与上述讨论一致，说明竹节香附素A可促进ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达及ROS表达，进而激活 ULK1/Atg13及ROS通路进而诱导肝癌细胞自噬。

综上所述，竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞自噬及凋亡；其机制与竹节香附素A可促进ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表达及ROS表达，激活ULK1/Atg13及ROS通路有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

赵利：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；马向明：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；王瑛：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；吉瑞更：进行统计学分析；付庆江、曹立瀛：课题设计，论文撰写