通络软坚胶囊配合熊去氧胆酸对自身免疫性肝病患者肝功能及血清Th17与Treg表达的影响

沈丽贤 李学 李惠文 王晓玲 张亚芹 吴淑娜 李瑶 田甜甜

河北中医肝病医院肝病一科（石家庄050800）

自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，ALD）是一种以肝脏损害为特征的慢性疾病，包括自身免疫性肝炎（AIH）、原发硬化性胆管炎（PSC）、原发胆汁性肝硬化（PBC）［1］。近年来，中医学辨证施治在ALD 治疗方面展现出良好前景，中医学认为ALD 的病因病机为本虚标实，本虚为阴虚、阳虚、或阴阳两虚，标实为痰瘀阻络［2-3］。临床中多采用熊去氧胆酸治疗，它是一种无毒的亲水性胆酸，具有改善ALD 患者肝功能、抑制肝纤维化的作用，但整体效果不尽理想［4］。中药制剂通络软坚胶囊具有益气通络、活血化瘀、祛痰软坚之功效，适用于ALD 的治疗。此外，相关研究指出，T 细胞17（T helper cell 17，Th17）与调节性T 细胞（T regu⁃latory cell，Treg）的失衡在ALD 的发生发展中具有重要促进作用［5-6］。基于此，本研究初次联合熊去氧胆酸及通络软坚胶囊对ALD 患者实施治疗，从血清Th17 与Treg 表达等方面探究其应用效果。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年10月至2018年10月我院120 例ALD 患者进行前瞻性研究，依据随机数字表法分为研究组与对照组，各60 例。两组性别、年龄、病程、体质量、病情分期、合并症对比，差异均无统计学意义（P> 0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较Tab.1 Clinical characteristics of patients in two groups例（%）

1.2 病例选择标准纳入标准：（1）符合ALD 诊断标准［7］；（2）中医辨证分型为脾气亏虚、痰瘀阻络证；（3）初发ALD；（4）年龄18～60 岁；（5）自身抗体阳性，肝功能异常；（6）肝功能Child⁃pugh 分级A级；（7）患者知晓本研究，已签署同意书。排除标准：（1）病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝炎等其他肝脏疾病患者；（2）精神系统疾病患者；（3）有肝胆手术史者；（4）近期采用免疫抑制剂等其他药物治疗者，或对本研究药物过敏者；（5）严重消化系统疾病、血液系统疾病患者；（6）心肺脑肾功能严重不全者；（7）胆道完全阻塞者；（8）不能配合完成研究者；（9）妊娠或哺乳期女性。

1.3 治疗方法两组患者均予对症支持治疗和糖皮质激素治疗，在此基础上，对照组采用熊去氧胆酸（湖北潜龙药业有限公司，国药准字H42021252，规格：50 mg/片）治疗，口服，250 mg/次，3 次/d。研究组于对照组基础上采用通络软坚胶囊（河北中医肝病医院制剂室生产，批准文号：冀药制字Z20050531，规格：0.4 g/粒），口服，2.8 g/次，2 次/d。两组均以3 个月为1 个疗程，持续治疗4 个疗程，治疗期间忌食油腻、辛辣刺激性食物，忌酒。

1.4 观察指标

1.4.1 两组临床效果4 个疗程结束后进行评估，评估标准［8］：显效：患者症状及体征明显改善，肝功能及血清免疫球蛋白指标较治疗前改善>50%；有效：症状及体征较前有好转，肝功能及血清免疫球蛋白指标较治疗前改善>30%～50%；无效：未达以上标准；（显效+有效）/总例数×100%=总有效率。

1.4.2 两组治疗前、治疗后肝功能指标采集患者空腹状态下外周静脉血8 mL，置于长沙湘智离心机仪器有限公司生产的TDZ6⁃WS 型离心机上，以3 500 r/min 转速、8 cm 半径离心处理5 min，取血清，均分成4 份，置于-70 ℃冰箱内备用，取血清标本，由专业检测师采用德国西门子BNII 全自动生物化学分析仪测定肝功能指标水平。包括血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotrans ferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（ala⁃nine aminotransferase，ALT）水平。

1.4.3 两组治疗前、治疗后肝纤维化指标包括Ⅳ型胶原（Ⅳ⁃collagen，Ⅳ⁃C）、Ⅲ型前胶原（procol⁃lagen⁃Ⅲ，PC⁃Ⅲ）、层粘连蛋白（laminin，LN）、透明质酸（hyaluronic acid，HA），取血清标本，采用放射免疫法测定上述指标水平，试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司。

1.4.4 两组治疗前、治疗后免疫指标包括免疫球蛋白M（Immune globulin M，IgM）、IgG，取血清标本，采用免疫荧光法检测血清IgM、IgG 水平，试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4.5 两组治疗前、治疗后血清Th17、Treg、Th17/Treg 表达取血清标本，采用贝克曼Coulter Epics XL 型流式细胞仪测定上述指标表达情况。

1.4.6 两组不良反应观察记录2 组患者治疗期间低血钾、腹泻、皮疹、头晕头痛、恶心呕吐等不良事件发生情况。

1.5 统计学方法数据处理采用SPSS 22.0 软件，呈正态分布的计量资料以（±s）表示，治疗前后比较采用配对t检验，2 组之间采用成组t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床效果比较治疗4 个疗程后，研究组总有效率为95.00%，显著高于较对照组的81.67%，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组临床效果比较Tab.2 The comparison of the curative effect between two groups 例（%）

2.2 肝功能比较治疗前两组血清TBIL、DBIL、AST、ALT 水平差异无统计学意义（P>0.05），治疗后两组血清TBIL、DBIL、AST、ALT 水平较治疗前降低，且研究组低于对照组（P<0.05）。见表3。

表3 两组肝功能指标比较Tab.3 The comparison of liver function indicators between two groups ±s

表3 两组肝功能指标比较Tab.3 The comparison of liver function indicators between two groups ±s

注：与同组治疗前对比，aP<0.05

时间治疗前例数60 60治疗后组别研究组对照组t 值P 值研究组对照组t 值P 值60 60 TBIL（μmol/L）76.31±8.34 74.91±7.98 0.940 0.349 31.53±5.30a 40.32±6.23a 8.324<0.001 DBIL（μmol/L）137.28±56.75 140.31±53.64 0.301 0.764 20.56±5.07a 28.29±6.69a 7.133<0.001 AST（U/L）141.38±29.37 139.40±31.26 0.358 0.721 35.15±8.21a 46.80±7.31a 8.209<0.001 ALT（U/L）218.34±33.40 221.91±35.64 0.566 0.572 37.50±7.67a 53.71±8.51a 10.960<0.001

2.3 肝纤维化比较治疗前两组血清Ⅳ⁃C、PC⁃Ⅲ、LN、HA 水平差异无统计学意义（P>0.05），治疗后两组血清Ⅳ⁃C、PC⁃Ⅲ、LN、HA 水平较治疗前降低（P< 0.05），且研究组低于对照组（P< 0.05）。见表4。

2.4 血清IgM 及IgG 水平比较治疗前两组血清IgM 及IgG 水平差异无统计学意义（P>0.05），治疗后两组血清IgM 及IgG 水平较治疗前降低，且研究组低于对照组（P<0.05）。见表5。

2.5 血清Th17、Treg 及Th17/Treg 表达比较治疗前两组血清Th17与Treg、Th17/Treg表达差异无统计学意义（P>0.05），治疗后两组血清Th17与Th17/Treg 表达较治疗前降低，血清Treg 表达较治疗前增高，且研究组血清Th17 与Th17/Treg 表达低于对照组，血清Treg表达高于对照组（P<0.05）。见表6。

表4 两组肝纤维化指标比较Tab.4 The comparison of the liver fibrosis indicators between two groups ±s，μg/L

表4 两组肝纤维化指标比较Tab.4 The comparison of the liver fibrosis indicators between two groups ±s，μg/L

注：与同组治疗前对比，aP<0.05

时间治疗前例数60 60治疗后组别研究组对照组t 值P 值研究组对照组t 值P 值60 60Ⅳ⁃C 196.21±34.14 194.41±32.35 0.296 0.767 103.20±23.21a 130.14±25.35a 6.071<0.001 PC⁃Ⅲ210.39±52.50 208.25±49.38 0.230 0.819 100.07±25.39a 129.64±30.14a 5.812<0.001 LN 181.12±46.45 178.70±44.69 0.291 0.772 111.78±36.40a 132.23±40.36a 2.915 0.004 HA 271.68±50.01 268.91±46.93 0.313 0.755 94.85±33.03a 115.73±36.21a 3.300 0.001

表5 两组血清IgM 及IgG 水平比较Tab.5 The comparison of the serum IgM&IgG between two groups ±s，g/L

表5 两组血清IgM 及IgG 水平比较Tab.5 The comparison of the serum IgM&IgG between two groups ±s，g/L

注：与同组治疗前对比，aP<0.05

组别研究组对照组t 值P 值例数60 60 IgM治疗前5.59±2.16 5.83±2.04 0.626 0.533治疗后1.41±0.96a 2.98±1.01a 8.727<0.001 IgG治疗前30.39±6.25 28.91±5.97 1.326 0.187治疗后14.53±4.41a 20.29±5.56a 6.287<0.001

表6 两组Th17 与Treg 表达比较Tab.6 The comparison of the Th17&Treg between two groups ±s

表6 两组Th17 与Treg 表达比较Tab.6 The comparison of the Th17&Treg between two groups ±s

注：与同组治疗前对比，aP<0.05

时间治疗前例数60 60治疗后组别研究组对照组t 值P 值研究组对照组t 值P 值60 60 Th17（%）4.41±1.06 4.36±1.10 0.254 0.800 0.95±0.34a 1.38±0.44a 5.990<0.001 Treg（%）2.92±0.87 2.89±0.90 0.186 0.853 6.51±1.50a 4.40±1.39 7.992<0.001 Th17/Treg 1.51±0.51 1.50±0.49 0.120 0.913 0.15±0.06a 0.31±0.15a 7.671<0.001

2.6 不良反应比较两组患者治疗过程中均发生轻微不良反应，不良反应总发生率对比差异无统计学意义（P>0.05）。见表7。

表7 两组不良反应比较Tab.7 Comparison of adverse reactions between two groups例（%）

3 讨论

ALD 是一种特殊类型的肝脏疾病，多发于青中年女性，临床普遍认为发病率较低，诊断较为困难，尚缺乏统一有效的治疗方案，是目前的难点和热点疾病。英国新近一项研究表明，其发病率为2.8/10 万，女性高于男性，年老者高于年轻人群。10年累积全因病死率为31.9%［9］。ALD 的基础病理改变是一种炎性反应，临床表现为转氨酶升高，抗核抗体、抗平滑肌抗体阳性，免疫球蛋白G升高［10］。ALD 发病机制复杂，目前存在各种假说和理论，包括感染与分子模拟学说、自身免疫紊乱学说，另外，关于遗传因素在其发病中的作用也多有报道［11-12］。BIEWENGA 等［13］研究发现补体系统在ALD 的发病中亦扮演了重要的角色。各种免疫因子目前尚无特异性生物学标志物或组织学标志物，患者只能做出临床诊断。对于ALD 的治疗，常规治疗以糖皮质激素或免疫抑制剂为主，一线用药推荐硫唑嘌呤，但长期应用激素治疗不良反应多，患者耐受性差。对反应不完全或不耐受者，可予应用麦考酚酯，亦能获得一定疗效［14-15］。

近年来，熊去氧胆酸在肝胆疾病中的作用越来越受临床重视，该药物呈弱碱性，口服后通过被动扩散迅速吸收，可竞争性抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，同时能竞争性取代细胞膜和细胞器上毒性胆酸分子，防止肝细胞和胆管细胞受到毒性胆酸的损害，发挥保护、改善肝功能的作用［16］。此外，熊去氧胆酸通过降低疏水胆酸的刺激作用间接抑制组织相容性复合体Ⅰ类和Ⅱ类基因的表达，并通过激活糖皮质激素受体直接抑制上述基因的表达，发挥免疫调节作用。本研究将熊去氧胆酸应用于ALD 患者，治疗总有效率为81.67%，可见其治疗效果良好，但仍有可提升空间。

中医学经典中无自身免疫性肝病记载，通过临床辨证多将其归属于“黄疸”“胁痛”“痞满”“臌胀”等范畴，认为ALD 属本虚标实，本虚以肝肾阴虚为主，标实以湿热为主，并夹气滞、血瘀等，伴随冲任虚损、气血不足、阴阳失调、阴血不足等生理病理改变，又复感湿热之邪，肝络郁滞而发病，湿毒之邪易留滞，湿阻脾胃，正虚邪恋，气机郁滞，血运不畅，又可形成瘀血，终成本虚标实、虚实夹杂之证候［17］。针对此病因病机，应遵循益气健脾、活血化瘀、软坚散结、疏肝通络的治疗原则。通络软坚胶囊由炙黄芪、鳖甲、穿山甲、丹参等诸味中药组成，方中鳖甲咸寒，入肝脾血分，具有软坚散结、滋阴清热之功效，穿山甲可透达经络，二者为本方主药，合用可通络软坚、消癥化积；炙黄芪具有益气健脾之功效，牡蛎化痰软坚，桃仁、丹参、泽兰能活血祛瘀，丝瓜络解毒通络、清热凉血，佐以当归养血柔肝、活血化瘀，小蓟凉血止血、清热解毒，郁金辛开苦降、芳香宜达，既入气分以行气解郁，又入血分以凉血逐瘀，且能引诸药直达肝经。全方合用，具有益气健脾、活血通络、化痰软坚之功效。现代药理学研究表明，鳖甲中含有鳖多糖，具有免疫促进作用；穿山甲含硬脂酸、胆甾醇等多种成分，具有改善血液循环及抗炎等作用；黄芪中有效成分皂苷具有一定的改善微循环、抗炎及镇痛作用；丹参有效成分具有改善肝微循环的作用，同时能抑制过度增生的纤维母细胞，起到抑制肝脏纤维化的作用［18］。基于此，本研究将通络软坚胶囊与熊去氧胆酸联合应用于ALD 患者，结果发现二者联合治疗的总有效率提高至95.00%，且能进一步抑制肝纤维化，改善机体免疫功能，促进肝功能提高。

ALD 的发病与自身免疫反应有关，Th17 是机体防御方面的重要细胞因子，近年来其因参与介导多种自身免疫性疾病的发展而备受关注［19-20］。国外文献研究［21］指出，自身免疫性肝炎患者外周血Th17 表达升高，Treg 表达下降，Treg 作为炎性介质在ALD 的发病中发挥着一定的作用，它通过甲基化修饰从而促进病情进展。另有研究发现ALD患者体内Treg甲基化水平高于正常人群［22］，也证明了这一观点。Th17与Treg的动态平衡被打破，引发机体免疫功能紊乱，促进疾病的发生发展［23-25］。在ALD 患者体内，Th17 表达增加可促进白细胞介素22 等炎性因子在炎症部位聚集，加重肝细胞损伤，加剧肝纤维化［26-27］。本研究发现，联合应用通络软坚胶囊与熊去氧胆酸治疗ALD 患者，能进一步降低Th17 与Th17/Treg 表达，增强Treg 表达，促进Th17 与Treg 的动态平衡恢复，从而改善肝功能，增强疗效，这与通络软坚胶囊、熊去氧胆酸均具有改善机体免疫功能、抗炎等作用，联合应用可发挥协同作用有关。本研究还发现加用通络软坚胶囊未明显增加药物不良反应，具有一定安全性。但本研究仍存在一定不足，如未进行长期随访，远期疗效尚未明确，有待日后进一步深入探究。

综上可知，给予ALD 患者通络软坚胶囊联合熊去氧胆酸治疗的疗效显著，能进一步调节Th17与Treg 表达平衡，在改善机体免疫功能、抑制肝纤维化、增强肝功能等方面具有明显优势，且具有一定安全性，值得临床推广应用。