lncRNA KB⁃7G2.9在新发2型糖尿病患者血清中的表达及对胰岛β细胞凋亡的影响

刘铮 王晔 施毕旻 孙丽丽 杨春梅

1苏州大学附属第一医院内分泌科（江苏苏州215006）；2武汉大学人民医院内分泌科（武汉430060）

糖尿病是人类主要慢性疾病之一，以慢性高血糖为特征的代谢异常综合征［1-2］，严重威胁人们生命健康［3-4］。2 型糖尿病占糖尿病总数的95%［5-6］。胰岛β细胞的凋亡是2 型糖尿病发病的重要机制［7］。探究胰岛β细胞凋亡的分子机制，对糖尿病的防治研究可能具有重要的临床意义。长链非编码RNA（long⁃chain non⁃coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 个碱基的转录本，不能编码蛋白［8-9］。近年研究［10-11］表明，lncRNA 可调控基因表达，影响细胞生命活动，参与糖尿病、高血压、肿瘤等疾病的发生。lncRNA 可稳定存在于血清，血清lncRNA在疾病诊疗过程中发挥生物标记物作用［12-13］。血清KB⁃7G2.9 是一种新发现的lncRNA，其在疾病特别是糖尿病中的作用及机制尚未见报道。本研究旨在检测糖尿病患者血清中KB⁃7G2.9 的表达，分析血清KB⁃7G2.9 与2 型糖尿病患者胰岛功能的相关性，探讨KB⁃7G2.9 对胰岛β细胞凋亡的作用及其机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取本院内分泌科门诊2019年1-11月就诊的新发2 型糖尿病患者26 例为研究对象，其中男17 例，女9 例。选取本院2019年3-12月体检中心的健康体检者26 例为对照组，对所有对照体检者进行糖耐量试验，排除糖尿病患者。本研究经本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 材料MIN6细胞购于上海生命科学院细胞所；Lipofectamine 2000 转染试剂购于美国Invitrogen 公司；质粒购于上海吉玛公司；WST⁃1 细胞增殖试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒购自美国Sigma 公司；高糖DMEM 培养基和胎牛血清购于美国Gibco 公司；细胞凋亡检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司；一抗购于英国Abcam 公司。

1.3 身高、体质量及临床血生化指标检测所有研究对象均在空腹下测量身高、体质量及采集静脉血。体质量指数（BMI）=体质量/身高2。检验科检测胰岛素（FIN）、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）等指标的水平。稳态模型评估胰岛β细胞功能指数（HOMA⁃β）=20×FIN/（FBG⁃3.5），FIN单位为μU/mL，FBG 单位为mmol/L。

1.4 细胞培养和转染MIN6 细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基中培养，条件为37 ℃、5%CO2。将细胞根据随机数字法分为阴性对照组和KB⁃7G2.9 组，根据Lipofectamine2000 说明书分别转染阴性对照质粒和KB⁃7G2.9 过表达质粒。

1.5 qRT⁃PCR 法提取血清或细胞总RNA 并逆转录为cDNA，荧光定量PCR试剂盒扩增目的基因。KB⁃7G2.9 引物序列：上游5′⁃CCTTGCTCTTTAAGG⁃AAGTAGAGAGA⁃3′；下游5′⁃ATCCCGGATTGCTT⁃TCAAC⁃3′。GAPDH 引物序列：上游5′⁃TCCCATC⁃ACCATCTTCCA⁃3′，下游5′⁃CATCACGCCACAGTT⁃TCC⁃3′。PDCD5 引物序列：上游5′⁃ GGCCCAACA⁃GGAAGCAAAG⁃3′；下游5′⁃GGCCGACTGATCCAG⁃AACTT⁃3′。基因相对表达量以2-ΔΔCt表示。

1.6 WST⁃1 法检测细胞增殖能力将各组细胞消化和重悬，以3×103个/孔接种至96 孔板。每孔加入适量WST⁃1 试剂，酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度（OD）值，分别于接种后第1、2、3、4、5 天检测。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率将各组细胞消化、收集，每组加5 μL Annexin V⁃FITC 染色液，室温下避光孵育10 min，每组加10 μL PI 染色液，室温下避光孵育6 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.8 Western blot 检测将各组细胞消化、收集，提取总蛋白。行SDS⁃PAGE胶电泳，转膜后用5%脱脂牛奶封闭，在4 ℃下一抗孵育，次日孵育二抗，滴加ECL 发光显影液，曝光显影。

1.9 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，正态分布资料采用两独立样本t检验比较组间差异，两变量之间的线性关系采用Pearson 相关性分析。以P< 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征糖尿病患者和健康体检者年龄、性别、身高、体质量指标间的差异无统计学意义（P> 0.05）。与健康体检者相比，糖尿病患者FIN 和HOMA⁃β均降低（均P< 0.01），FBG、HbA1c 均增加（均P<0.01）。见表1。

2.2 KB⁃7G2.9 表达与2 型糖尿病患者胰岛功能的相关性与健康体检者相比，2 型糖尿病患者血清中KB⁃7G2.9 表达增加（1.22±0.15vs.3.69±0.21，P<0.01），见图1。Pearson 相关性分析显示，KB⁃7G2.9 与FIN（r=-0.71，P< 0.01）、HOMA⁃β（r=-0.81，P<0.01）呈负相关，与HbA1c（r=0.79，P<0.01）呈正相关，见图2。

2.3 qRT⁃PCR 检测转染效率与阴性对照组比较，KB⁃7G2.9 组KB⁃7G2.9 表达增加（1.03±0.14vs.12.91±1.26，P<0.01），表明转染成功。

表1 糖尿病患者和同期体检健康者的临床特征Tab.1 Clinical characteristics of diabetic patients and healthy people ±s

表1 糖尿病患者和同期体检健康者的临床特征Tab.1 Clinical characteristics of diabetic patients and healthy people ±s

变量年龄（岁）性别（男/女）BMI（kg/m2）FIN（μU/mL）HOMA⁃β FBG（mmol/L）HbA1c（%）2 型糖尿病患者52.99±2.13 18/8 23.21±0.66 3.61±0.12 7.74±0.67 14.81±0.68 7.31±0.30体检健康者48.47±2.18 15/11 22.96±0.82 5.34±0.21 21.43±1.14 5.27±0.23 4.11±0.22 P 值0.15 0.40 0.81<0.01<0.01<0.01<0.01

图1 2 型糖尿病患者和体检健康者血清KB⁃7G2.9 表达Fig.1 The expression level of serum KB⁃7G2.9 in patients with type 2 diabetes and healthy people

2.4 WST⁃1 法检测转染后细胞增殖与阴性对照组比较，转染KB⁃7G2.9 后细胞增殖能力下降（P<0.05），表明KB⁃7G2.9 可抑制MIN6 细胞增殖。见图3。

图2 KB⁃7G2.9 表达与FIN、HOMA⁃β、HbA1c 指标的Pearson 相关性分析Fig.2 Pearson correlation analysis of KB⁃7G2.9 expression and FIN，HOMA⁃β，HbA1c indicators respectively

图3 WST⁃1 法检测各组细胞增殖Fig.3 WST⁃1 method was used to detect the proliferation ability of cells in each group

2.5 流式细胞术检测转染后细胞凋亡率与阴性对照组比较，KB⁃7G2.9 组细胞凋亡率增加［（9.33±2.07）%vs.（28.28±3.13）%，P<0.01］，KB⁃7G2.9 可促进MIN6 细胞凋亡。

2.6 qRT⁃PCR 检测转染后细胞PDCD5 mRNA 的表达与阴性对照组比较，KB⁃7G2.9 组细胞中PDCD5 mRNA 的表达较阴性对照组增加（1.03±0.13vs.9.31±1.26，P<0.01）。

2.7 Western blot 检测Western blot 结果显示，与阴性对照组比较，KB⁃7G2.9 组程序性细胞死亡因子5（PDCD5）表达增加，细胞凋亡促进蛋白Bax 和Bad 表达增加，细胞凋亡抑制蛋白Bcl⁃2 和c⁃IAP1表达降低（图4）。

3 讨论

胰岛β细胞凋亡导致胰岛素分泌不足，是部分2 型糖尿病患者发病的重要机制［14］。lncRNA 既往被认为是转录副产物，不具有生物学功能［3，15-16］。近年研究［17-19］显示，lncRNA 可调控基因的表达，广泛参与疾病的发生、发展。lncRNA 与糖尿病发生的不同阶段均有相关性，特别是参与视网膜病变、心肌病、非酒精性脂肪性肝炎等糖尿病并发症的调控［20-22］。lncRNA 在糖尿病中的研究有助于了解糖尿病的发生机制，lncRNA 已成为糖尿病生物标记物和靶向治疗研究的重点。

图4 Westen blot 检测各组细胞靶基因的表达Fig.4 Westen blot was used to detect the expression of target gene proteins in each group

本研究首次发现2 型糖尿病患者血清中KB⁃7G2.9 表达高于同期体检健康者，表明KB⁃7G2.9 可能与糖尿病发生发展有关。本研究发现2 型糖尿病患者KB⁃7G2.9 表达与FIN、HOMA⁃β呈明显负相关，与HbA1c 呈明显正相关，KB⁃7G2.9 表达增加可能与胰岛β细胞功能降低有关。胰岛β细胞凋亡导致胰岛素分泌降低，是胰岛β细胞功能降低的重要机制［23］。本研究通过将KB⁃7G2.9 过表达质粒转染MIN6 细胞，细胞增殖能力降低，细胞凋亡率增加，表明KB⁃7G2.9 可抑制MIN6 细胞增殖，加速细胞凋亡。PDCD5参与调控细胞的凋亡，通过抑制相关蛋白质的合成，促进细胞的凋亡，PDCD5 高表达与糖尿病的发生相关［24-25］。qRT⁃PCR 检测表明，过表达KB⁃7G2.9 后，PDCD5 mRNA 表达增加，表明KB⁃7G2.9 可促进PDCD5 基因的表达。Western blot显示，PDCD5 蛋白表达增加后，细胞凋亡促进蛋白Bax 和Bad 表达增加，细胞凋亡抑制蛋白Bcl⁃2和c⁃IAP1 表达降低。上述结果显示，KB⁃7G2.9可能通过上调PDCD5 基因表达，促进胰岛β细胞系的凋亡。KB⁃7G2.9 调控PDCD5 的具体作用机制尚不明确，是下一步研究的重点。

综上所述，血清KB⁃7G2.9 在2 型糖尿病患者中的表达高于体检健康者，血清KB⁃7G2.9 与胰岛β 细胞功能呈负相关，KB⁃7G2.9 可能通过促进PDCD5 基因表达，加速胰岛β细胞凋亡。KB⁃7G2.9可能成为2 型糖尿病早期诊断和罹患风险评估的血清lncRNA 标志物。