超表达桃树PpADC基因导致番茄矮化和晚花研究

王保全，张晓娜，李国怀

(1.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070；2.河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡 453003)

多胺(PAs)是一类具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱，广泛存在于原核和真核生物体中。植物体内具有重要生物功能的多胺主要有腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)等[1-2]。多胺参与植物种子形成、器官发育、果实成熟和衰老进程调控等多种生理生化过程，还参与植物的多种生物和非生物胁迫应答反应[3-5]。植物体内多胺的生物合成反应主要由精氨酸脱羧酶(ADC)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC)、亚精胺合成酶和精胺合成酶分别催化完成[6]，腐胺位于多胺生物合成途径的中心位置，腐胺的生物合成代谢由ODC介导的直接途径和ADC催化的间接途径完成[7]。

植物ADC基因最早从燕麦植物中获得克隆[8]，在番茄、拟南芥和烟草等模式植物中ADC基因拷贝数和基因序列存在一定的差异性。ADC基因在拟南芥中有2个基因拷贝，基因AtADC2在拟南芥渗透胁迫应激反应中起主导作用[9]；番茄ADC基因拷贝数与拟南芥一致，SlADC1和SlADC2基因序列均不含有内含子结构，高温和H2O2处理能诱导基因SlADC1和SlADC2转录表达，伤害和低温处理仅能诱导基因SlADC2转录表达[10]。烟草NtADC基因编码721个氨基酸，ADC蛋白存在于烟草花、种子、茎、叶和根等组织器官，定位于细胞核和叶绿体2个不同的亚细胞区[11]。苹果MdADC、葡萄VvADC、桃PpADC、枳PtADC和芒果MiADC等多种果树植物ADC基因与烟草NtADC具有相似的基因序列，并且果树ADC基因在植物生长发育和逆境胁迫应答过程中受到不同模式的转录表达调控[12-14]。

随着ADC基因从越来越多植物中获得克隆，其在植物体内的生物功能也得到深入的发掘和验证。ADC基因参与了植物的生长发育和逆境胁迫应答过程[15-16]，枳PtADC基因超表达载体遗传转化拟南芥、番茄和烟草等模式植物，转基因植株均表现出腐胺含量增加，活性氧(ROS)清除能力增强，从而使转基因植株在干旱逆境胁迫条件下表现出较高的抵抗力[13,17]。在拟南芥中，ADC基因的超量表达系和突变体均能改变植株的抗逆性。超量表达拟南芥AtADC2基因可提高转基因植株体内腐胺的积累，增强植株对干旱、盐碱胁迫的抗逆性[18-19]；缺失突变拟南芥AtADC1、AtADC2基因，突变体植株的游离腐胺含量明显降低，表现出更强的盐胁迫或低温敏感性，外施腐胺能缓解突变体植株冻害的逆境压力[20-21]。同时，对拟南芥ADC基因突变体研究还发现，AtADC1和AtADC2在拟南芥响应低温胁迫过程中存在功能冗余性，但AtADC1对病原菌有特异性诱导，AtADC2对拟南芥应答病原菌过程中的ADC总活性起着主要作用[22-23]。通过T-DNA插入突变，获得拟南芥2个ADC基因的双突变体，通过突变体杂交无法获得双突变体基因型的活子代，表明AtADC基因在拟南芥正常种子发育过程中是不可或缺的[24]。目前，ADC基因的功能鉴定与分析主要集中于植物逆境胁迫应答反应过程，其在植物生长发育过程中的研究相对较少。鉴于此，基于克隆到的桃PpADC基因，通过构建超量表达载体，遗传转化Micro-Tom番茄，分析PpADC基因在桃树生长发育过程中的生物学功能，从而为发掘和评价桃树优良抗性种质提供基因资源，拓展ADC基因在果树生长发育和逆境胁迫应答过程中的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

番茄Micro-Tom购自南京丰硕园艺有限公司。番茄植株生长于25 ℃光照培养箱，光周期8 h/16 h，播种后21、35、49 d的转基因番茄和野生型番茄用于植株生长发育观测，取播种后35 d的番茄叶片进行多胺含量测定和相关基因表达量分析。赤霉素处理：配制含有表面活性剂吐温20的赤霉素溶液(100 μmol/L)，选取苗龄41 d的转基因阳性植株，喷施番茄叶背面1次，通过测量植株的株高(顶端组织与第1片真叶之间的长度)，分析外源赤霉素对转基因植株生长发育的影响。

大肠杆菌感受态细胞DH5α和根癌农杆菌感受态GV3101均为华中农业大学园艺林学学院采后生物学实验室保存。限制性内切酶SmaⅠ、XbaⅠ、PstⅠ、RNA提取试剂盒和Taq酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司，cDNA第一链合成试剂盒购自Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成，测序由北京六合华大基因科技股份有限公司武汉分公司完成。

1.2 方法

1.2.1PpADC基因超量表达载体构建 基于PpADC基因编码序列和pBI121载体的多克隆位点，在基因编码序列两端设计添加酶切位点的引物(PpADC-XbaⅠ-F，PpADC-SmaⅠ-R)，以限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ酶切PCR产物和pBI121载体，分别回收、纯化双酶切产物，16 ℃连接，转化大肠杆菌DH5α构建PpADC-pBI121中间载体。以限制性内切酶PstⅠ和SmaⅠ酶切中间载体和pCAMBIA1391Z载体，酶切产物分别回收、纯化、连接、转化大肠杆菌DH5α，从而构建PpADC基因超量表达载体。重组载体构建成功后将其转化根癌农杆菌GV3103，并存于-76 ℃超低温冰箱备用。

1.2.2 转基因材料获得与鉴定 将构建的PpADC超量表达载体应用农杆菌介导法遗传转化番茄Micro-Tom[17]，设计重组载体和外源基因组合引物(35S-F，PpADC-R)，PCR鉴定转基因材料，收获阳性植株的种子为T0代，播种后再次经过PCR鉴定得到T1代阳性植株，用于后续PpADC基因表达量测定和抗性分析。

1.2.3 转基因植株中相关基因的表达量测定 番茄RNA提取参照Trizol试剂盒说明书(TaKaRa，大连)，cDNA合成参照cDNA第一链合成试剂盒说明书(Invitrogen，上海)进行，以番茄β-Actin基因为内参，引物为β-Actin-F、β-Actin-R(表1)，采用半定量PCR方法分析转基因植株中PpADC、SlGA2ox1(NM_001247936)、SlGA3ox1(AB010991)、SlGA20ox1(AF049898)、SlGA20ox2(AF049899)基因的表达量[25]。PpADC基因检测引物为PpADC-PF、PpADC-PR，SlGA2ox1基因检测引物为SlGA2ox1-F、SlGA2ox1-R，SlGA3ox1基因检测引物为SlGA3ox1-F、SlGA3ox1-R，SlGA20ox1基因检测引物为SlGA20ox1-F、SlGA20ox1-R，SlGA20ox2基因检测引物为SlGA20ox2-F、SlGA20ox2-R。PCR反应程序：94 ℃，预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃(PpADC、SlGA3ox1、SlGA20ox1、SlGA20ox2)、60 ℃(SlGA2ox1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，29(PpADC)、33(SlGA2ox1)、32(SlGA3ox1、SlGA20ox1、SlGA20ox2)个循环，72 ℃延伸7 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表1 转基因材料PCR检测及半定量PCR引物

1.2.4 多胺含量测定 多胺的提取和测定方法、步骤参照前人研究[26]。安捷伦高效液相色谱系统(HPLC，Agilent 1200)用于多胺含量的测定，检测器为紫外检测器，检测波长为230 nm，流动相为50%甲醇和50%水混合溶液，流速为1 mL/min，进行梯度洗脱，色谱柱为安捷伦C18反向色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为25 ℃。

1.3 数据处理

试验设3次重复，采用Microsoft Excel软件对数据进行处理及绘图，采用SPSS Statistics软件中LSDtest进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 PpADC转基因番茄的获得和鉴定

潮霉素抗性筛选和PCR检测用于鉴定PpADC转基因番茄。应用根癌农杆菌介导的Micro-Tom番茄遗传转化体系，获得了68棵具有潮霉素抗性的植株，经PCR鉴定获得38棵转基因阳性植株，采收种子后，取9个T0代进行播种，并进行PCR鉴定，PpADC基因在转基因株系#21、#58的T1代植株中基本符合3∶1分离规律，表明该基因在转基因株系#21、#58中为单基因插入，这2个转基因株系适用于后续PpADC基因超表达检测(图1)。

M:DL 2000;+:pADC超量表达载体质粒;-:野生型番茄;1—10:转基因株系#21;11—20:转基因株系#58

2.2 PpADC基因在转基因番茄中的表达量分析

半定量PCR用于检测转基因株系#21和#58植株体内PpADC基因的表达量。结果表明，PpADC基因在野生型番茄中没有表达，而在转基因株系#21和#58中检测到PpADC基因的超量表达(图2)。

图2 PpADC基因在野生型(WT)和转基因株系(#21、#58)中的表达量

2.3 转基因番茄中多胺含量分析

对于腐胺而言，野生型番茄含量为64.17 nmol/g，而转基因株系#21和#58植株含量分别为80.56、83.53 nmol/g，并显著高于野生型番茄25.54%、30.17%(P<0.05)；亚精胺在野生型番茄中含量为72.89 nmol/g，在转基因株系#21和#58植株中含量分别为79.84、84.30 nmol/g，高于野生型番茄9.53%、15.65%，但差异不显著(P>0.05)；与腐胺相似，野生型番茄中精胺含量为15.36 nmol/g，而转基因株系#21和#58植株中精胺含量显著增加(P<0.05)，分别达到24.64、23.26 nmol/g，高于野生型番茄60.42%、51.43%(图3)。上述结果表明，外源基因促进了番茄植株中腐胺、亚精胺和精胺等含量上升。

同一物质不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.4 转基因番茄植株发育迟缓分析

转基因株系T0代植株存在个体发育迟缓的现象，为了分析PpADC基因在植物生长发育过程中的生物学功能，对野生型番茄和转基因株系#21和#58植株的株高进行了评估。播种后21 d时，野生型番茄和转基因株系#21和#58植株株高的个体差异不明显。播种后35 d时，野生型番茄的株高明显高于转基因株系#21和#58植株，这种差异主要体现在新生茎段的茎间长度。播种后49 d，野生型番茄的株高仍然明显高于转基因株系#21和#58植株，并且野生型番茄呈现开花盛期，而转基因株系#21和#58植株处于花蕾期或初花期(图4)。

A：播种后21 d；B：播种后35 d；C：播种后49 d

2.5 转基因番茄赤霉素代谢相关基因表达量分析

赤霉素代谢影响着植株正常的生长发育，为了解析超量表达PpADC基因是否会在转录水平调控番茄体内赤霉素生物合成，对转基因植株体内赤霉素代谢相关基因的表达量进行了半定量PCR检测。结果表明，GA20ox1和GA3ox1基因在转基因株系#21和#58植株中表达量明显低于野生型番茄；但GA2ox1基因表达量在野生型番茄和转基因株系中没有明显差异；相对野生型番茄，GA20ox2基因的表达量在转基因株系#21植株中明显较低，在转基因株系#58植株中差异不明显(图5)。

图5 赤霉素合成相关基因在野生型(WT)和转基因株系(#21和#58)中表达量分析

2.6 外源赤霉素对转基因株系生长发育的恢复作用

播种后20 d时，野生型番茄平均株高0.64 cm，转基因株系#21平均株高为0.62 cm，低于野生型番茄3.13%，转基因株系#58平均株高为0.66 cm，高于野生型番茄3.13%，差异都不显著(P>0.05)(图6A1、B1)；播种后41 d时，野生型番茄生长正常，平均株高4.21 cm，而转基因株系#21、#58生长显著矮化(P<0.05)，平均株高分别为2.06、2.15 cm，低于野生型番茄51.07%、48.93%(图6A2、B2)；以赤霉素溶液喷施苗龄41 d的转基因番茄，喷施后10 d后，野生型番茄平均株高4.33 cm，转基因株系#21、#58植株的平均株高分别为3.96、4.05 cm，分别低于野生型番茄8.55%、6.47%，差异不显著(P>0.05)，外源喷施赤霉素能恢复转基因植株株高，但开花进程仍然明显落后于野生型番茄(图6A3、B3)。

A1、B1:播种后20 d;A2、B2:播种后41 d;A3、B3:播种后51 d

3 结论与讨论

转基因技术为研究多胺在植物生长发育和逆境胁迫应答过程中的生物学功能提供了有效的途径，植物超量表达外源ADC基因可以导致体内腐胺的积累，ADC基因功能缺失突变体植株体内多胺含量明显降低[15,27]。本研究中，PpADC基因遗传转化番茄Micro-Tom后，在转基因番茄中正常超量表达，2个转基因株系的腐胺、亚精胺和精胺含量均明显高于野生型番茄。转基因水稻中也发现了类似的结果，腐胺和精胺在超量表达燕麦ADC基因的转基因水稻植株体内积累[28]。因此，我们推测植物体内ADC基因高效表达产生腐胺积累，才能引起亚精胺和精胺含量增加，从而触发植物体内多胺代谢。然而腐胺的积累不一定导致亚精胺和精胺的增加，在杨树和拟南芥中超量表达小鼠ODC基因导致转基因植株腐胺含量增加数倍，但亚精胺和精胺含量没有明显变化[29]。推测这种差异可能与植物体内腐胺合成由ADC和ODC 2条途径相关。

植物内源多胺含量影响着植物的生长发育，突变体和转基因植物体内多胺含量变化造成了植株表型的改变，然而，多胺在植物生长发育过程中的确切作用还不清楚[30]。相对于野生型植株，超量表达PpADC的转基因植株展现出生长发育迟缓和晚花的表型，主要表现在茎节长度明显缩短。类似的表型也出现在其他转基因植物中，超量表达燕麦ADC基因的转基因烟草体内腐胺含量明显增加，ADC活性明显高于对照，转基因植株呈现出节间缩短的表型[31]。PtADC超量表达载体遗传转化柑橘，不仅提高了转基因植株的抗旱、抗寒能力，而且还使转基因植株表现出矮化的性状[32]。拟南芥超量表达AtADC2基因的转基因植株伴随ADC2基因表达量的提高，体内腐胺含量明显增加，植株表现出矮化和晚花性状[33]。这些研究支撑了ADC基因的高效表达能提高植物体内腐胺合成，从而引起植物生长矮化的假设。但这个假设并不适用于ODC基因合成腐胺途径，在产生高水平scFvODC1的转基因烟草中，植物体内ODC活性受到抑制，腐胺、亚精胺和精胺含量均明显减少，转基因植株生长异常并表现出矮化的性状[34]。

赤霉素在植物体内不仅影响茎的伸长，同时对植株叶片伸展、成花诱导和花药发育起着重要的调控作用[35]。超量表达AtADC2基因导致转基因植物节间缩短和开花延迟，外施赤霉素能有效恢复植物的正常生长发育[33]。与AtADC2转基因拟南芥相似，外源喷施能恢复超量表达PpADC基因番茄的株高，但转基因番茄的花期仍然延迟于野生型番茄，这可能与外源赤霉素的喷施时期相关。GA20ox、GA2ox和GA3ox是植物体内赤霉素生物合成途径中的3个加双氧酶，它们负责催化GA12最终生成其他种类的赤霉素[36]。本研究中PpADC基因超量表达导致转基因番茄体内腐胺积累增加，基因GA3ox1、GA20ox1和GA20ox2下调表达，这表明腐胺可能作为内源信号调控赤霉素合成代谢相关基因的表达，从而使植物正常的赤霉素合成代谢受到抑制，赤霉素含量的降低导致植株生长缓慢，并影响了植株的正常开花进程。这个推测在拟南芥研究中得到验证，正常条件下，过量表达AtADC2基因的植株体内赤霉素减少，导致植株矮化和开花推迟[37]。

多胺参与了植物生长发育过程中的多种生理生化反应，植物体内的多胺合成和降解受到精确机制的调控，过多或过少的多胺含量都会导致植株生长异常[38]。PpADC转基因番茄植株内源多胺含量及其表型的变化有力地支撑了多胺参与植物的生长发育调控的理论。植物体内多胺和赤霉素代谢网络途径存在交叉，但赤霉素在植物生长发育中的多重作用决定了其调控机制的复杂性[39-40]。因此，PpADC基因对植株内源赤霉素合成的调控作用及其途径有待进一步研究。