蜘蛛香提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用

秦 枫，刘 云，吴 植，吴 双，郭长明，顾玲玲，吴晓洁，朱善元

(1.江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300; 2.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种急性、接触性、高度传染性疾病，通常表现为母猪的繁殖障碍(如晚期流产、死产和木乃伊)以及新生仔猪和断奶仔猪的呼吸系统疾病(如间质性肺炎)[1-3]，给全球养猪业造成了巨大的经济损失[4]。当前，控制和预防该病的主要措施是接种疫苗。灭活苗具有安全、贮存和运输方便等优点，但其免疫次数多、成本较高[5]；弱毒苗具有免疫力强、免疫期长的优点，但其存在污染环境、毒力返强等问题[6]。因此，迫切需要开发安全、有效且廉价的抗PRRSV的药物。

中药对病毒具有多重作用，毒副作用小且很少产生耐药性，一些中药还具有解热、增强机体免疫功能等优势。PU等[7]的研究结果表明，贯叶连翘提取物能极显著(P<0.01)降低PRRSV病毒滴度，KANG等[8]研究发现，箬竹提取物(SQE)显著改变了PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞中细胞因子基因的表达，表明SQE影响了病毒感染期间炎症反应的调节。蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)为败酱科缬草属植物，又名马蹄香、老虎七、土细辛等，微苦、辛、温，归心、脾、胃经，具有理气止痛、祛风除湿、活血消肿的功效[9-10]。蜘蛛香中含主要含有挥发油类、生物碱类、黄酮类和环烯醚萜类等多种成分，具有镇静、镇痛、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗焦虑和抗抑郁等药理作用。马丽娟[11]研究发现，蜘蛛香能够治疗犬病毒性肠炎。但目前关于蜘蛛香抗PRRSV的研究还未见报道。为此，探讨蜘蛛香水提物及醇提物的体外抗PRRSV的效果，旨在为开发抗PRRSV药物提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒与中药材

Marc-145细胞和PRRSV SH1705毒株均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存。中药材蜘蛛香购自安国药源商贸有限公司，经江苏农牧科技职业学院动物药学院于生兰教授鉴定为败酱科植物蜘蛛香的干燥根茎，标本存放于江苏农牧科技职业学院中兽药与天然药物研发中心。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 DMEM培养基购自美国Hyclone公司；细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等均购自美国Gibco公司；青链霉素混合液(100×)、二甲基亚砜(DMSO)等均购自北京索莱宝科技有限公司；噻唑蓝(MTT)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.2.2 主要仪器 生物安全柜由MVE公司生产；酶联免疫检测仪由Bioteck公司生产；CO2培养箱由NVAIRE公司生产；ABI-7300型实时荧光定量PCR仪、-80 ℃ 超低温冰箱均由Thermo公司生产；倒置荧光显微镜由Olympus公司生产。

1.3 方法

1.3.1 中药提取

1.3.1.1 蜘蛛香水提物的制备 用传统水煎煮法提取蜘蛛香水提液。称取蜘蛛香药材20 g，粉碎至粉末，10倍水浸泡过夜，煎煮2次，30 min/次，合并滤液，浓缩至浸膏状。

1.3.1.2 蜘蛛香醇提物的制备 称取蜘蛛香药材20 g，粉碎至粉末状，10倍的60%乙醇浸泡过夜后加热回流提取3次(第1次2 h，第2、3次分别为1.5 h)，合并滤液，减压浓缩至浸膏状[12]。

将上述2种提取液-80 ℃预冻过夜，冷冻干燥机干燥，称质量，计算得率。

1.3.2 药物安全性测定

1.3.2.1 Marc-145细胞培养 取出冻存在液氮中的细胞，立即置于37 ℃ 恒温水浴锅中，不停摇动，使其快速融化。将该细胞转入含有预热完全的培养基的离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，用预热完全的培养基将其重悬后加入细胞培养瓶中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养[13]，细胞长至单层后进行消化，传代备用。

1.3.2.2 药物安全性试验 采用MTT法[14]检测药物对细胞的抑制率，测定其在490 nm处的OD值，根据OD值计算细胞生长抑制率。

将细胞瓶中长至单层的细胞消化后，计数，用含10% FBS的DMEM稀释至约2×105个/mL，加入96孔板，每孔100 μL细胞悬液。待细胞长至单层后，弃去培养液，第1～10列依次从低质量浓度至高质量浓度加入以安全质量浓度起始的药液，每个质量浓度梯度重复4孔，每孔100 μL，11～12列加入细胞培养液作为细胞对照，置于 5% CO2、37 ℃培养箱中。培养72 h后，弃去药液，加入MTT溶液(PBS溶解，2 g/L)，50 μL/孔，培养4 h后，弃去MTT溶液，加入DMSO完全溶解结晶，测定OD490值。计算生长抑制率：生长抑制率=(细胞对照组OD490-药物组OD490)/细胞对照组OD490×100%。

1.3.3 PRRSV病毒滴度测定

1.3.3.1 PRRSV的扩增 将细胞瓶中长至单层的细胞消化后，弃去旧培养液，用 PBS洗2遍。用含2% FBS的DMEM培养液稀释 PRRSV，接种病毒液至细胞中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每天观察，当细胞出现80%～90%病变时，终止培养。将病变细胞在-80 ℃与4 ℃反复冻融3次后，收集细胞悬液，5 000 r/min 离心5 min，收集上清液[15]，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装至EP管内，标注分装时间及批次等，置于-80 ℃备用。

1.3.3.2 TCID50法测定病毒滴度 用不含血清的DMEM培养液将病毒液按照10倍比依次稀释成10-1～10-8，8个梯度，接种于96孔细胞培养板上，100 μL/孔。每个稀释度接种8孔，同时设立PRRSV对照组和细胞对照组，置于5% CO2、37 ℃培养箱培养2 h后，弃去病毒液，加入细胞维持液，观察5～7 d，记录细胞病变情况，采用Reed-Muench法计算TCID50[16]。

1.3.4 蜘蛛香提取物体外抗PRRSV的效果测定 以各提取物的最大安全质量浓度为起始质量浓度，用含2% FBS的DMEM培养液2倍比稀释成4个质量浓度梯度，每个质量浓度梯度重复4孔，PRRSV液稀释度为100 TCID50,另设利巴韦林阳性对照，PRRSV对照及细胞对照，进行阻断作用试验、抑制作用试验和直接灭活试验。于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养，每天观察细胞病变(CPE)的情况，待PRRSV对照组细胞病变程度达到80%～90%后，用MTT法测各孔OD490值，计算细胞保护率：细胞保护率=(加药组OD490值-PRRSV对照组OD490值)/(细胞对照组OD490值-PRRSV对照组OD490值)×100%。

1.3.4.1 直接灭活试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，同时加入50 μL药液和50 μL病毒液(使药液最高质量浓度为最大安全质量浓度和病毒液终含量为100 TCID50)，培养4 h后，弃去药液，加入含2% FBS的DMEM培养液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率，筛选出对病毒的抑制率高于50%的蜘蛛香提取物作后续研究。

1.3.4.2 阻断作用试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入以最大安全质量浓度为起始质量浓度的药液，每孔100 μL，培养4 h后，弃去药液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培养2 h后，弃去病毒液，加入含2% FBS的DMEM培养液。

1.3.4.3 抑制作用试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培养2 h后，弃去病毒液，加入以最大安全质量浓度为起始质量浓度的药液，每孔100 μL，培养4 h后，弃去药液，加入含2% FBS的DMEM培养液。

1.4 数据处理

每天用显微镜观察CPE情况并记录，且根据药物对病毒的抑制率评价其抗病毒的效果，抑制率越高，说明其抗病毒作用越强。采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 蜘蛛香提取物得率

称得蜘蛛香水提物和蜘蛛香醇提物干燥后粉末质量分别为7.82 g和7.24 g，得率分别为39.1%和36.2%。

2.2 蜘蛛香提取物对细胞的安全质量浓度测定

细胞病变观察结果发现，不同药物对Marc-145细胞都有一定程度的毒性作用，并且药物质量浓度越高毒性作用越强，主要表现为细胞折光性增加，变圆、粘连、破碎，出现空泡，甚至脱落。当抑制率为0时，则该质量浓度下药物对细胞没有毒性作用。根据公式计算药物对细胞的生长抑制率，从而确定药物的最大安全质量浓度，结果见表1。蜘蛛香水提取物及醇提取物、利巴韦林的最大安全质量浓度分别为1.250、0.625、0.016 g/L。

表1 不同质量浓度蜘蛛香提取物和利巴韦林对Marc-145细胞的抑制率及最大安全质量浓度

2.3 PRRSV的TCID50测定结果

根据公式计算得到PRRSV对Marc-145细胞的TCID50为10-3.6/mL。

2.4 蜘蛛香提取物抗PRRSV的药效

2.4.1 对PRRSV的阻断作用 MTT检测中药OD490值，当OD490值越高时，说明药物对细胞的保护作用越强，即对PRRSV的抑制作用越强，蜘蛛香2种提取物的直接灭活作用对PRRSV的抑制率见表2。从表2可以看出，蜘蛛香水提物、蜘蛛香醇提物和利巴韦林对PRRSV的最高抑制率分别为44.6%、107.1%和63.3%。蜘蛛香醇提物对PRRSV的抑制率极显著(P<0.01)高于利巴韦林阳性对照组。

表2 不同质量浓度蜘蛛香提取物在阻断作用下对PRRSV的抑制率

由图1可以看出，蜘蛛香水提物组细胞出现明显病变，大多细胞出现团聚、圆缩现象，蜘蛛香醇提物组细胞出现轻微病变，部分细胞圆缩、团聚，但基本保持细胞单层完好。与PRRSV对照组相比，蜘蛛香水提物组细胞形态略好，蜘蛛香醇提物组细胞形态基本完好。与利巴韦林阳性对照组相比，蜘蛛香水提物组病变现象较为严重。

A.蜘蛛香水提物；B.蜘蛛香醇提物；C.利巴韦林。下同

2.4.2 对PRRSV的抑制作用 从表3可以看出，蜘蛛香水提物、蜘蛛香醇提物和利巴韦林对PRRSV的最高抑制率分别为37.9%、102.6%和68.9%。蜘蛛香醇提物对PRRSV的抑制率均极显著(P<0.01)高于利巴韦林阳性对照组。

表3 不同质量浓度蜘蛛香提取物在抑制作用下对PRRSV的抑制率

由图2可知，蜘蛛香水提物组细胞出现明显病变，大多细胞出现团聚、圆缩现象，蜘蛛香醇提物组细胞出现轻微病变，部分细胞圆缩、团聚，但基本保持细胞单层完好，蜘蛛香醇提物抗病毒效果明显强于蜘蛛香水提取物。与PRRSV对照组相比，蜘蛛香醇提物具有明显的抗病毒作用。与利巴韦林阳性对照组相比，蜘蛛香水提物组细胞病变现象较为严重，蜘蛛香醇提物组细胞形态基本完好。

图2 蜘蛛香提取物对PRRSV的抑制作用(40×)

2.4.3 对PRRSV的直接灭活作用 从表4可以看出，蜘蛛香水提物、蜘蛛香醇提物和利巴韦林对PRRSV的最高抑制率分别为83.5%、120.9%和65.5%。蜘蛛香水提物和醇提物对PRRSV的抑制率均极显著(P<0.01)高于利巴韦林阳性对照组。

表4 不同质量浓度蜘蛛香提取物在直接灭活作用下对PRRSV的抑制率

从图3可知，PRRSV对照组大部分细胞出现了圆缩、团聚、空泡甚至脱落的现象，而细胞对照组细胞保持单层完好。蜘蛛香水提物组和醇提物组基本保持细胞单层完好。而利巴韦林阳性对照组细胞病变略严重，细胞发生明显团聚、圆缩，并伴随有脱落现象，与利巴韦林阳性对照组相比，其病变现象较严重。

图3 蜘蛛香提取物对PRRSV的直接灭活作用(40×)

3 结论与讨论

猪繁殖与呼吸综合征是一种高度传染性病毒性疾病，该病已经给世界养猪业造成巨大经济损失。目前，还没有针对治疗猪繁殖与呼吸综合征的有效药物。中药因具有安全性高、毒副作用小等优势，可开发并将其用作治疗病毒性疾病的潜在药物。

本试验首先采用MTT法评价了蜘蛛香提取物对Marc-145细胞的毒性，结果显示，蜘蛛香水提物和醇提物的最大安全质量浓度分别为1.25 g/L和0.625 g/L。采用MTT法结合细胞形态观察，并以利巴韦林作为阳性对照，研究了蜘蛛香水提物及醇提物体外对PRRSV的抗病毒作用，结果表明，与利巴韦林阳性对照相比，蜘蛛香水提物和醇提物具有较强的体外抗PRRSV的作用，对PRRSV均具有较强的阻断、抑制和直接杀灭作用，且蜘蛛香醇提物抗PRRSV的作用较强。蜘蛛香提取物中的主要有效成分多为环烯醚萜类和黄酮类。姚干等[17]的研究结果表明，黄芩总黄酮和栀子总环烯醚萜苷组合物具有明显的抗病毒效应，其作用机制可能是抑制病毒在细胞内的增殖和对病毒的直接灭活作用。黄酮具有抗多种病毒的作用，对乙肝病毒[18]、柯萨奇病毒[19]、烟草花叶病毒[20]等都有明显的抗病毒效果。由此推测，蜘蛛香提取物抗病毒作用的成分可能为黄酮类或环烯醚萜类成分。

本研究证实了蜘蛛香提取物体外抗PRRSV的作用，为蜘蛛香用于抗PRRSV的防治提供了重要依据，其抗PRRSV的作用机制及在体内的抗病毒活性有待进一步研究。