非洲猪瘟病毒MGF505-5R蛋白表达与纯化

张素玲，吴 芃，岳亚男，白晨雨，郝丽影，李向东，逄文强，田克恭

(国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471003)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种高致死性传染病。ASFV具有双层囊膜结构，基因组大小约180～190 kb[1]，编码160多种蛋白质，其中50多种为病毒结构蛋白[2-3]。

ASFV基因组包含几个不同的多基因家族，其中MGF360和MGF505位于基因组高度可变的左端区域，由其编码的蛋白质对ASFV的复制及感染均具有重要的影响[4-7]。ASFV编码的多基因家族能够抑制感染的巨噬细胞产生Ⅰ型IFN应答，MGF360和MGF530/505等多个基因缺失后，可导致Ⅰ型IFN在感染巨噬细胞中的诱导水平增加，且缺失后的毒株对Ⅰ型IFN敏感，表明这些基因具有抑制IFN应答和抗病毒状态的功能[8-9]。敲除ASFV强毒株MGF360和MGF505/530中的多个基因后，病毒在巨噬细胞中的复制能力未受影响，但对家猪的致病力发生降低；该毒株免疫后能够针对亲本毒株提供较好的攻毒保护，其保护水平和免疫剂量、亲本毒株类型和缺失的基因有关[10-12]。上述研究均表明，以多基因家族为靶点的基因缺失疫苗研制是ASFV免疫防控的重要方向之一。因此，体外表达具有生物学活性的MGF蛋白和制备相应的单克隆抗体或多克隆抗体成为免疫学诊断方法建立的前提。

大肠杆菌是用于外源蛋白表达的常用宿主菌株，但是表达的外源蛋白易形成包涵体，不具有生物活性。利用能够增强重组蛋白可溶性表达的融合标签SUMO[13-14]、TrxA[15]、GST[16]、MBP[17]和NusA[18]可以提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达水平。鉴于此，通过标签筛选、优化表达和纯化条件，以获得高纯度可溶性ASFV MGF505-5R蛋白，并制备特异性的多克隆抗体，旨在为ASFV基因缺失疫苗的免疫学鉴别诊断方法的建立奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒和菌株

质粒pET28a购自Novagen公司；菌株DH5α、E.coliBL21(DE3)均购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP、pET28a-NusA均为国家兽用药品工程技术研究中心构建。

1.2 主要试剂

DL2000 Marker、限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo Fisher公司；2×EasyTaqPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白质预染Marker购自Thermo Fisher公司；Ni2+亲和层析填料、MBP亲和层析柱均购自美国GE Healthcare公司；羊抗鼠IgG-HRP二抗购自Abbkine公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 基因的扩增及重组表达载体的构建 经过密码子优化的MGF505-5R基因由金唯智合成。根据合成的基因设计1对特异性引物，F：5′-CGCGGATCCATGTTCTCTCTGCAGGAAAT-3′；R：5′-CCGCTCGAGTTATTCGTAACGCATGTCGG-3′，其中下划线位置为酶切位点。以合成的MGF505-5R基因为模板进行PCR扩增并回收。将回收的MGF505-5R片段和pET28a载体同时用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后回收，酶切产物经T4 DNA连接酶连接，构建pET28a-MGF505-5R载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将菌液均匀涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板，37 ℃培养过夜。挑取单克隆菌落进行PCR鉴定并送金唯智进行测序。以国家兽用药品工程技术研究中心前期构建的pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP和pET28a-NusA5个质粒为模板，利用表1中的引物分别PCR扩增His-SUMO、His-TrxA、His-GST、His-MBP和His-NusA基因片段并回收。将回收的5个片段分别用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切后回收，然后分别与NdeⅠ和BamHⅠ酶切后的pET28a-MGF505-5R载体连接，构建pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R表达载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板上，37 ℃培养过夜。挑取单克隆菌落进行PCR鉴定并送金唯智进行测序，将5种测序正确的质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞。

表1 引物序列

1.3.2 重组蛋白表达与可溶性分析 将5种重组质粒分别转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，37 ℃培养过夜后挑取单克隆菌落接种于含有100 mg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃摇床(220 r/min)过夜培养。将培养过夜的种子按1%的接种量接种于含卡那霉素的LB培养液中，37 ℃摇床(220 r/min)培养至OD600为0.5～0.6时，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，分别在20 ℃和28 ℃条件下诱导表达10 h。表达结束后，离心收集菌体细胞。按照菌体∶重悬液=1∶10的比例加入PBS，充分重悬菌体细胞。超声破碎后，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，采用灰度扫描分析法分析重组蛋白表达水平和可溶性。根据初步表达结果，选择可溶性表达较好的菌株进行诱导剂含量和诱导时间的优化，并进行SDS-PAGE检测分析。

1.3.3 重组蛋白的纯化 取pET28a-MBP-MGF505-5R转化的E.coliBL21(DE3)按照优化的表达条件大量诱导表达。诱导后的菌体加PBS重悬后，800 bar高压均质破碎。破碎后的样品4 ℃、12 000 r/min离心1 h，取上清用0.45 μm滤膜过滤后，分别用Ni2+亲和层析和MBP亲和层析进行纯化。Ni2+亲和层析用咪唑梯度进行洗杂和洗脱，MBP亲和层析选用麦芽糖梯度进行洗杂和洗脱。收集的洗脱蛋白用PBS缓冲液透析后，加入TEV蛋白酶将MBP标签蛋白切除，然后加入Ni2+填料，4 ℃过夜孵育吸附MBP标签蛋白，离心取上清用12% SDS-PAGE检测。

1.3.4 动物免疫 MGF505-5R蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1混合后乳化，以每只小鼠100 μg的剂量对6周龄雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；以弗氏不完全佐剂充分乳化MGF505-5R蛋白，并按相同方式和剂量于21、42、63 d进行免疫。最后一次免疫结束后7 d采血，分离血清，采用间接ELISA法检测免疫血清的抗体效价。

1.3.5 重组蛋白的Western blot分析 纯化后的MGF505-5R蛋白电泳后，采用半干法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，含5%脱脂牛奶粉的封闭液25 ℃封闭2 h，然后加入1∶500稀释的鼠抗MGF505-5R蛋白血清，4 ℃孵育过夜后弃去，PBST反复洗涤3次。再加入1∶5 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP二抗，室温孵育1 h后弃去，PBST反复洗涤3次。用DAB显色试剂盒显色后，观察结果。

2 结果与分析

2.1 MGF505-5R重组载体的构建与鉴定

以合成的MGF505-5R基因为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，从图1可以看出，扩增的MGF505-5R基因片段大小约为1 500 bp，与预期结果一致。MGF505-5R基因片段与pET28a载体连接的质粒测序结果正确，表明pET28a-MGF505-5R载体构建成功。分别以国家兽用药品工程技术研究中心前期构建的5种质粒为模板，利用表1中的引物分别扩增5种融合标签蛋白的基因片段，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。从图2可以看出，His-SUMO基因、His-TrxA基因、His-GST基因、His-MBP基因和His-NusA基因片段大小分别约为350、300、700、1 000 bp和1 500 bp，均与预期基因片段大小相符。将5种重组质粒分别测序，测序结果与模板碱基序列一致，表明重组表达载体pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R均构建成功。

M：DL2000 Marker；1：MGF505-5R基因

M：DL2000；1：His-SUMO基因；2：His-TrxA基因；3：His-GST基因；4：His-MBP基因；5：His-NusA基因

2.2 MGF505-5R重组蛋白表达与可溶性分析

分别取5种菌株表达的上清和沉淀20 μL，加入5 μL 5×Loading Buffer，沸水加热10 min，进行SDS-PAGE检测分析。从图3可以看出，28 ℃诱导表达时，5种菌株均大量表达重组蛋白，但是均为包涵体；20 ℃诱导表达时，SUMO-MGF505-5R、GST-MGF505-5R和TrxA-MGF505-5R重组蛋白仍为不溶性的包涵体，NusA-MGF505-5R和MBP-MGF505-5R重组蛋白可溶性表达水平提高，其中MBP-MGF505-5R蛋白的可溶性表达水平经过灰度扫描分析可知提高约20%。

A：重组蛋白28 ℃诱导表达结果(M：蛋白质Marker；1、3、5、7、9、11分别为28 ℃诱导表达后的全菌裂解上清；2、4、6、8、10、12分别为28 ℃诱导表达后的全菌裂解沉淀)；B：重组蛋白20 ℃诱导表达结果(M：蛋白质Marker；1、3、5、7、9、11分别为20 ℃诱导表达后的全菌裂解上清；2、4、6、8、10、12分别为20 ℃诱导表达后的全菌裂解沉淀)

对MBP-MGF505-5R重组蛋白的表达条件进行了优化，即在20 ℃条件下，设置IPTG浓度梯度：0.2、0.5、0.8 mmol/L，分别诱导8 h和12 h取样检测分析MBP-MGF505-5R重组蛋白可溶性表达水平。从图4可以看出，当IPTG浓度为0.5 mmol/L时，MBP-MGF505-5R重组蛋白可溶性表达量最高，但是进一步增加诱导剂浓度到0.8 mmol/L时，MBP-MGF505-5R重组蛋白可溶性表达水平下降，说明最适诱导剂浓度为0.5 mmol/L。在IPTG浓度为0.5 mmol/L的诱导条件下，诱导时间增加，MBP-MGF505-5R重组蛋白的可溶性表达量提高。

A：重组蛋白诱导表达8 h结果(M：蛋白质Marker；1、3、5分别为IPTG浓度为0.2、0.5、0.8 mmol/L诱导表达8 h后的全菌裂解上清；2、4、6分别为IPTG浓度为0.2、0.5、0.8 mmol/L诱导表达8 h后的全菌裂解沉淀)；B：重组蛋白诱导表达12 h结果(M：蛋白质Marker；1、3、5分别为IPTG浓度为0.2、0.5、0.8 mmol/L诱导表达12 h后的全菌裂解上清；2、4、6分别为IPTG浓度为0.2、0.5、0.8 mmol/L诱导表达12 h后的全菌裂解沉淀)

2.3 MBP-MGF505-5R重组蛋白的纯化

MBP-MGF505-5R重组蛋白N端含有6×His融合标签，可以利用MBP 亲和层析和Ni2+亲和层析进行纯化。为了获得纯度较高的目的蛋白，分别进行上述2种纯化试验。洗脱的MBP-MGF505-5R重组蛋白12%进行SDS-PAGE检测，结果(图5A)显示，目的蛋白分子质量约为100 ku。灰度扫描分析结果显示，Ni2+亲和层析纯化后纯度约为80%，MBP亲和层析纯化后纯度大于90%。去除MBP标签后，经12% SDS-PAGE检测，结果(图5B)显示，MGF505-5R分子质量约为55 ku。

A：MBP-MGF505-5R重组蛋白的纯化(M：蛋白质Marker；1：MBP亲和层析纯化MBP-MGF505-5R重组蛋白；2：Ni2+亲和层析纯化MBP-MGF505-5R重组蛋白)；B：MGF505-5R蛋白的纯化(M：蛋白质Marker；1：MGF505-5R蛋白)

2.4 MGF505-5R蛋白多克隆抗体的制备

用纯化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠后，采集并分离小鼠血清进行间接ELISA检测血清效价，结果显示，免疫后的小鼠血清效价达到1∶12 800以上，表明MGF505-5R蛋白活性良好，具有免疫原性，能够刺激机体产生抗体。

2.5 MGF505-5R蛋白的生物活性分析

Western blot结果显示，PVDF膜上出现了分子质量约为55 ku的特异性条带，表明MGF505-5R蛋白活性良好，且免疫小鼠后能产生特异性抗体(图6)。

M：蛋白质Marker；1：MGF505-5R蛋白

3 结论与讨论

ASFV基因组可编码多种蛋白质，用于调控宿主细胞蛋白质表达、干扰宿主天然免疫系统和调控细胞周期等，从而抑制和逃避宿主的免疫应答，其中ASFV编码的免疫逃避蛋白MGF360和MGF505/530是基因缺失疫苗研制的主要靶标之一。KING等[19]将ASFV弱毒株OURT88/3进行了部分MGF基因的缺失，与亲本病毒相比，MGF基因缺失毒株可以诱导产生较高水平的IFN，且可提供针对同源病毒的保护力。因此，多基因家族基因缺失疫苗有望应用于临床，成为预防非洲猪瘟的商业化疫苗。吴映彤[20]建立了针对MGF360-12L和MGF360-13L的分子检测方法，并利用大肠杆菌原核表达载体对MGF360-12L和MGF360-13L蛋白进行了表达，并对表达的MGF360-12L和MGF360-13L包涵体蛋白进行了纯化，为多克隆抗体的制备和间接ELISA检测方法的建立奠定了基础。包涵体蛋白因其空间结构不正确，可能不具有生物学活性。因此，利用具有生物学活性的多基因家族蛋白制备相应的单克隆抗体或多克隆抗体，对多基因家族基因缺失疫苗的免疫学鉴别诊断具有重要意义。

本研究选用原核表达系统，通过标签筛选成功获得了可溶性的ASFV MBP-MGF505-5R重组蛋白，并利用纯化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠制备了特异性的多克隆抗体。ASFV强毒或弱毒株缺失MGF360和MGF530/505基因后免疫动物，可以提供针对同源病毒或部分异源病毒的攻毒保护[21-22]。因此，本研究制备的多克隆抗体有望用于ASFV MGF505相关基因缺失疫苗的临床免疫学鉴别检验，为进一步建立鉴别诊断方法奠定了基础。