复合菌种发酵烟叶产酶及挥发性风味物质变化

帅 瑶，陶 菡，田运霞，田永锋，程 凯，何腊平

(1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025; 2.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650000)

烟叶发酵是改善烟叶品质的重要手段。未经处理的原料烟具有刺激性大、不协调等缺点，通过接种微生物对烟叶进行人工发酵已成为改善烟叶品质最常用的手段[1]。烟叶表面存在着大量微生物且种类繁多[2]，烟叶发酵是复杂微生物群落在结构和组成上发生变化的过程[3]。目前，烟叶的人工控制发酵研究多采用单菌株发酵，利用复合菌株发酵烟叶的研究相对较少。但实践发现，很多重要生化过程仅靠单株微生物不能完成或只能微弱地进行, 必须依靠2种或多种微生物共同培养来完成[4]，即混菌发酵。混菌发酵，是采用2种或多种微生物的协同作用共同完成某种发酵过程，是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。研究表明，混合菌种发酵的产品品质明显强于单一菌种发酵[5]。近年来，通过在烟草发酵过程中选择适当的微生物和适宜的发酵条件，来提高烟叶的质量和香气[6]、生产或提高酶活力[7]已有报道。冯颖杰等[8]利用鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.XP降解复烤后烟叶中的多酚类物质；李浩宇等[9]筛选出菌株后，添加到烟叶进行发酵从而改善烟叶品质；李士林等[10]等利用从烟叶筛出的耐高温菌株进行发酵，通过降解淀粉和蛋白质提高烟叶品质。鉴于此，利用贵州大学酿酒与食品工程学院食品工业应用微生物课题组(以下简称课题组)筛选出的具有烟叶提质效果的GUHP86、GZU03菌株进行复合发酵，研究其发酵特性，建立合适的发酵工艺，并对其进行气相-质谱联用仪(GC-MS)检测挥发性风味成分，分析微生物发酵对烟叶风味的影响。通过复合菌种进行烟叶发酵，建立发酵工艺，分析挥发性风味成分与烟叶品质之间的关系，为生产高质量烟叶提供混菌发酵工艺。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂

口含烟烟草原料大理红大CL314由云南工业有限责任公司提供。

菌种为课题组筛选出的解淀粉芽孢杆菌GUHP86(中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC M 2016003)，拉丁文学名：Bacillusamyloliquefaciens；GZU03(中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC M 2018762)。

福林酚试剂购自上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产色谱纯或分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基和有糖盐溶液配制 种子液体培养基：胰蛋白胨1.25 g/L、酵母提取物0.625 g/L、NaCl 6.25 g/L、葡萄糖0.625 g/L，配好后按三角瓶容量的20%分装入三角瓶，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。含糖盐溶液：准确称取MgCl25 g、KCl 0.5 g、CaCl20.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，补水至1 000 mL，溶解灭菌后备用。

1.2.2 烟叶发酵 原料烟切丝，宽度1 mm左右，称取20 g于121 ℃条件下灭菌5 min。解淀粉芽孢杆菌GUHP86、GZU03接种于种子液体培养基，于37℃、180 r/min培养18 h，培养液于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取菌体沉淀，加入等体积无菌生理盐水重悬，得菌体重悬液。灭菌后烟叶置于密封袋内，吸取适量菌体重悬液于烟叶，适量含糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，37 ℃培养箱内进行发酵。每天对其进行换气。

1.2.3 烟叶发酵单因素试验 称取烟叶20 g，切丝灭菌备用，固定接种量20%，发酵温度37 ℃、发酵15 d。分别考察GZU03和GUHP86复配比例(1∶3、1∶1、3∶1、0∶4、4∶0)、葡萄糖添加量(0.04%、1.00%、2.00%、10.00%)、大豆蛋白添加量(0.50%、1.00%、1.50%、2.00%)、水分含量(30%、35%、40%、45%、50%)对烟叶感官及蛋白酶活力的影响。

1.2.4 烟叶发酵 Plackett-Burman试验设计 通过Plackett-Burman试验对可能影响烟叶感官值的参数，包括复配比例、接种量、水分含量、葡萄糖添加量、大豆蛋白添加量进行主效应分析，选用n=5的设计，每个因素取高、低2个水平，以感官值为指标，筛选出主要的影响指标。试验设计水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平

1.2.5 烟叶发酵中心组合设计(Central composite design,CCD)优化设计 在Plackett-Burman试验基础上，选择接种量和葡萄糖添加量为因素，采用CCD的设计方案，因素水平见表2。

表2 CCD试验设计因子水平

1.2.6 感官评价 样品制备及感官评价方法参照文献[11]的方法，采用盲评的形式，总分100分，其中，入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性、滋味、余味各10分。

1.2.7 蛋白酶活力测定 精确称取磨碎的烟草原料样品1 g于烧杯中，用25 mL 磷酸盐(PBS)缓冲溶液浸提24 h，然后用慢速定性滤纸过滤，滤液待用。蛋白酶活力参照GB/T 23527—2009标准[12]进行测定。

1.2.8 GC-MS检测挥发性风味 将2 g烟叶放入10 mL顶空固相微萃取瓶中，将顶空瓶放入斯特斯(CTC)自动进样器品盘，设置萃取条件为70 ℃保持5 min，70 ℃吸附30 min，萃取盘转速为250 r/min，萃取得到的物质在气相色谱进样口进行解吸附，解吸温度250 ℃，时间5 min。

色谱柱:DB-wax(60 m×0.25 mm×0.25 mm)毛细管柱；进样口温度240 ℃；载气He，1.5 mL/min；分流比2∶1；升温程序：初始温度 40 ℃，保持 1 min，以10 ℃/min升至 120 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。传输线温度：240 ℃；电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描范围：33～350 amu；数据采集模式：全扫描。采用谱库检索定性。

1.3 数据处理

数据采用Design Expert 8.05b、Origin 9.0、SPSS 22.0软件进行分析, 测定3次以平均值±标准偏差表示，根据单因素方差(One-Way ANOVA)方法对数据进行差异显著性比较分析，P<0.05为数据之间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 复合菌种接种比例对发酵烟叶品质及蛋白酶活力的影响

解淀粉芽孢杆菌[13]发酵提高烟叶品质主要是由于微生物可将烟叶中的有机成分(如淀粉、蛋白质等大分子物质)用作自身代谢基质, 通过某些代谢途径最终将有机大分子成分转化为小分子物质[14-15]。单独GUHP86与GZU03发酵烟叶感官效果都有所提高，由此考虑复合菌发酵对烟叶品质的影响。如图1所示，与单菌发酵相比，复合菌种发酵后烟叶的感官品质有所提升，且以 GZU03和GUHP86的比例为1∶1时进行复合菌种发酵效果较好，此时烟叶的香气较浓，刺激性较少，整体较为谐调。而单菌发酵的烟叶香气稍差，不如复合菌种发酵烟叶谐调，说明复合菌种发酵提高了烟叶品质。自然发酵烟叶几乎不产蛋白酶，而混菌发酵烟叶产生了一定的蛋白酶活力，当进行复配时，可能会发生拮抗作用[16]从而导致蛋白酶活力下降。但是单独的GUHP86虽然蛋白酶活力较高，然而感官值不是最高的，这说明感官值虽然与蛋白酶活力相关但并不是越高越好，过量易导致一些刺激性风味如胺味等产生[17]。故选择GUHP86与GZU03复合发酵烟叶，复配比例为1∶1。

不同小、大写字母分别表示不同处理方式感官、蛋白酶活力具有显著性差异(P<0.05)，下同

2.2 葡萄糖添加量对发酵烟叶品质及蛋白酶活力的影响

葡萄糖易于被微生物直接利用，促进微生物生长。如图2所示，当葡萄糖添加量为1.00%时，发酵烟叶感官值(P<0.05)和蛋白酶活力(P<0.05)最高，而自然发酵只在葡萄糖添加量为10.00%检测到蛋白酶活力，而后在加菌发酵条件下继续增大葡萄糖添加量，感官值降低，这主要是因为葡萄糖过多，烟叶甜度过高，对烟叶风味有消极的影响。而且葡萄糖含量过高也会抑制代谢和产酶，故选择葡萄糖添加量为1.00%进行烟叶发酵。

Ⅰ—Ⅳ分别表示加菌发酵条件下葡萄糖添加量分别为0.04%、1.00%、2.00%、10.00%；Ⅴ—Ⅷ分别表示自然发酵条件下葡萄糖添加量分别为0.04%、1.00%、2.00%、10.00%

2.3 大豆蛋白添加量对发酵烟叶品质及蛋白酶活力的影响

大豆蛋白[18]为微生物的生长提供了一定的营养物质，对发酵烟叶感官品质提高有一定的积极作用。由如图3所示，当加菌发酵，大豆蛋白添加量为1.00%时，感官值最高，为90.33，并且此时加菌发酵烟叶蛋白酶活力最高，为20.38 U/g。且添加大豆蛋白后，蛋白酶活力比未添加(图2)时更高，说明大豆蛋白对蛋白酶产生有一定的促进作用，故选择大豆蛋白添加量为1.00%进行烟叶发酵。

Ⅰ—Ⅳ分别表示加菌发酵条件下大豆蛋白添加量分别为0.50%、1.00%、1.50%、2.00%；Ⅴ—Ⅷ分别表示自然发酵条件下大豆蛋白添加量分别为0.50%、1.00%、1.50%、2.00%

2.4 水分含量对发酵烟叶品质及蛋白酶活力的影响

水分是影响微生物生长的重要因素[19]，合适的含水量能为微生物提供更好的生存环境。水分主要影响发酵环境湿度，不同湿度对发酵烟叶品质的影响是显著的。由图4可知，加菌发酵条件下，水分含量在30%～40%时，感官值随着水分含量的增加而增加，当水分含量为40%时，到达感官最高值并得到最高蛋白酶活力，而后随着水分含量的增加，感官值逐渐下降。李晶晶等[20]研究发现，高湿环境下有利于抑制雪茄烟亚硝胺的产生和积累，李常军等[21]等认为，在高湿环境下有利于蛋白质降解和氨基酸的积累。但高水分环境更适于霉菌的生长[22]，水分含量过高时，烟叶稍有发霉现象。结合感官和蛋白酶活力，选择水分含量为40%进行烟叶发酵。

Ⅰ—Ⅴ分别表示加菌发酵条件下水分含量分别为30%、35%、40%、45%、50%；Ⅵ—Ⅹ分别表示自然发酵条件下水分含量分别为30%、35%、40%、45%、50%

2.5 Plackett-Burman试验结果

基于单因素试验结果，综合分析葡萄糖添加量、水分含量、复配比例、大豆蛋白添加量和接种量5个因素，利用Plackett-Burman试验筛选出对烟叶发酵过程影响较大的因素，结果如表3、4所示。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果

通过方差分析，得到以感官为响应值的线性回归方程：

Y=106.69-269.76×A-9.07×C-0.64×E-0.53×G-42.07×J。

根据方差分析得到回归模型，其中F值为5.900，P=0.025 9<0.05，表示模型显著，拟合程度较好。由表4可知，葡萄糖添加量与接种量对发酵烟叶感官有显著影响，其P值分别为0.040 4和0.007 7，均小于0.05，可以作为进一步优化的因素。而含水量、复配比例和大豆蛋白添加量没有显著影响，对结果影响不大，在进一步研究中，取中间水平，对影响效果不进行分析。

表4 偏回归系数及影响因子的显著性分析

2.6 CCD试验结果

基于单因素试验设计，对优化工艺进行了一系列的试验，在Plackett-Burman试验的基础上，根据CCD原理，试验安排及响应值结果见表5。

表5 响应面分析设计及结果

对表6中的回归模型进行分析，模型P值=0.003 1，极显著(P<0.01)，失拟项P值=0.647 4，不显著(P>0.05)，说明模型可靠，拟合情况较好，同时试验方法也是可靠的。R2=0.889 1，表明预测值与实际值之间具有高度相关性。校正系数RAdj2=0.809 8，变异系数为2.24，说明试验可靠性良好。响应面方程为Y=89.9+1.15×A+0.36×B-1.58×A×B-4.51×A2-3.01×B2。单因素A、B的F值的大小分别为2.92、0.28，提示单因素对感官的影响顺序为A(接种量)>B(葡萄糖添加量)。而且A2与B2的影响都是极显著，A2>B2，说明说明接种量、葡萄糖添加量两因素对感官不是简单的线性影响，也说明解淀粉芽孢杆菌的代谢作用也不是简单受因素的线性影响，这对于优化控制很关键。根据回归分析结果做出相应的响应面图及其等高线图(图5)，以确定接种量和加糖量的交互作用对发酵烟叶感官的影响，响应曲面陡峭，等高线呈密集椭圆形，响应面开口向下，表明随着因素的增大，响应值随之增大，当响应值达到极值后，因素增大但响应值逐渐减小[23]。

表6 回归模型系数及显著性检验

图5 接种量和葡萄糖添加量交互影响发酵烟叶感官曲面及等高线

2.7 最优工艺条件确定与模型验证

对所建立模型进行参数最优分析处理，得到最优发酵工艺为接种量为23.8%、葡萄糖添加量为1.13%，此时得到发酵烟叶预测感官值为88.38±0.799。基于对条件可操作性的考虑，进一步将最佳发酵条件修正为接种量24.0%、葡萄糖1.20%。使用该条件进行3次平行试验，最终得到发酵烟叶感官值为88.32，与预测值接近，证明响应面法得到的发酵烟叶工艺参数是真实可靠的。

2.8 GC-MS检测挥发性风味

对最优工艺烟叶样品利用GC-MS检测其挥发性风味物质，结果如表7所示。

表7 自然发酵和加菌发酵挥发性风味物质峰面积相对含量分析

分析表7，自然发酵检测到为81种物质、加菌发酵检测到82种物质。加菌发酵醛、酮、酸类物质种类较自然发酵有一定的增加，表明加菌发酵产生了一定的新物质，且醛、酮、酸类相对含量也有不同程度的增加，而这几种物质是很多风味的主要组成物质。烯烃和酯类等物质种类都减少，醇、酮类相对含量明显增加，烯烃类相对含量明显下降，自然发酵烯烃类相对含量为44.00%，加菌发酵仅为11.23%，自然发酵醇、酮类相对含量分别为9.71%、3.64%，加菌发酵醇、酮类分别为22.17%、11.89%。与自然发酵烟叶相比，加菌发酵烟叶烟碱含量明显下降，自然发酵烟碱相对含量为18.27%，而加菌发酵烟碱相对含量仅为11.43%，降低6.84个百分点。

3 结论与讨论

葡糖糖、大豆蛋白及水分都能影响解淀粉芽孢杆菌的生长，故影响对烟叶的发酵效果，合适的发酵条件能得到感官更好、蛋白酶活力更高的烟叶。

解淀粉芽孢杆菌可产生较多酶类，如蛋白酶、淀粉酶和葡萄糖苷酶等，它们能将原料中丰富的聚合淀粉和蛋白质分解为寡糖和单糖、多肽和氨基酸，共同促进微生物的生长和多种代谢物的生物合成[24]。加菌发酵烟叶醛类主要是糠醛(杏仁气味)和苯甲醛(浓郁的果香香韵)的增加，可能是因为蛋白酶将蛋白质分解为氨基酸等物质，氨基酸与糖发生反应，从而推动美拉德反应的发生[25]，而糠醛及5-羟甲基糠醛为美拉德反应产物，表现为相对含量增加，苯甲醛可能是氨基酸的Strecker reaction(斯特雷克反应)降解所产生[26]；酸类主要是丙酸的增加，研究表明，芽孢杆菌与酸类物质之间相关性显著[27]，解淀粉芽孢杆菌产生的蛋白酶可将烟叶中的蛋白质分解为氨基酸[28]，再参与解淀粉芽孢杆菌生长代谢，经代谢的氨基酸可能转化为酸类化合物，故酸类化合物相对含量增加。

烯烃、醇和酮类化合物的变化可能是因为烯烃容易被芽孢杆菌利用分解为醇类[29]，故醇类相对含量增加而烯烃类显著降低，加菌发酵烟叶苯甲醇相对含量较自然发酵明显增加，这可能是因为烟叶本身具有一定苯丙氨酸裂解酶活力[30]，芽孢杆菌促进了苯丙氨酸裂解酶产生从而促进苯丙氨酸裂解，产生了较多苯丙氨酸裂解产物如苯甲醇；酮类主要是5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮(具有奶油香、椰子香、辛香)、β-大马酮(玫瑰特征香气)、β-紫罗兰酮(木香和紫罗兰香)等物质相对含量增加，酮类化合物的增加可能是因为芽孢杆菌将一部分醇转化为酮和微生物，或芽孢杆菌产酶促进烟叶中类胡萝卜素降解[31]生成巨豆三烯酮、β-大马酮和β-紫罗兰酮等物质。烷烃类化合物相对含量明显增加，这可能是发酵过程中微生物代谢产生的[32]。

烟碱具有毒性，但又影响烟草制品的满足感[33]，通过微生物发酵降低烟碱含量是一个有效手段[34]。研究使用复合菌种发酵烟叶，在减少有害物质的同时大大增加了具有烟草辛辣味物质的相对含量，如叶绿醇[35]，降低了烟草对人体的有害性又保证了烟草的风味。叶绿醇是叶绿素的主要构件，叶绿醇与叶绿素转化降解为新植二烯，新植二烯本身具有清香气且刺激性较强[36-40]。2-乙基己醇表现为霉味，丙烯酸正丁酯、正己醛和正辛醛有刺激性。在加菌发酵烟叶中未检测出2-乙基己醇，且加菌发酵烟叶中的丙烯酸正丁酯、正己醛和正辛醛的相对含量低于自然发酵，表明接种复合菌解淀粉芽孢杆菌对减少烟草风味消极影响的物质有较好的作用。

由于复合解淀粉芽孢杆菌的作用产生较多代谢产物包括风味物质及减少刺激性化合物相对含量，且发酵产生了一定活力的酶如蛋白酶，将烟叶中的蛋白质分解为一些具有特殊风味的氨基酸参与微生物代谢，故在感官上，加菌发酵烟叶较自然发酵烟叶整体更为协调，香味复杂浓烈，劲头足，刺激性小，滋味丰富，风味更佳。

以烟叶为原料，利用课题组前期从腊肉中筛选出的GUHP86、GZU03菌株对烟叶进行混菌发酵，研究其发酵特性，得到具有较高蛋白酶活力且更高品质的烟叶。在单因素试验和Plackett-Burman试验的基础上，采用CCD响应面法对发酵条件进行探究，得到最佳发酵工艺。最佳发酵工艺为接种量24.0%、葡萄糖添加量1.20%、水分含量40%、复配比例(GZU03∶GUHP86)1∶1、大豆蛋白添加量1.00%。通过GC-MS分析挥发性风味成分发现，微生物发酵降低了烟碱相对含量，降低烟叶的有害性，且蛋白酶可将蛋白质分解用于解淀粉芽孢杆菌的生长代谢，微生物产生了较多代谢产物，包括一些具有特殊风味的物质，增加了烟叶风味多样性，得到整体更为协调、香味复杂浓烈、劲头足、刺激性小、滋味丰富、风味更佳的烟叶，提高了烟叶质量，为烟叶的混菌发酵技术开发提供一定的理论和技术参考。