改进高效液相色谱法快速准确地测定辣椒粉中苏丹红含量

2020-10-15侯冰

中国食品 2020年18期

苏丹红又名苏丹，是一种人工合成的化工染料，主要用于油彩、机油、蜡和鞋油等产品的染色。苏丹红是亲脂性偶氮化合物，主要有苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ四种物质。毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性，我国已经禁止在食品中使用。由于使用苏丹红染色的食品颜色非常鲜艳且不易褪色，一些不法食品生产者把苏丹红添加到食品中，常见的可能非法添加苏丹红的食品有辣椒粉、辣椒油、红心禽蛋等。

现阶段，食品中苏丹红含量的测定主要使用GB/T？19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法？高效液相色谱法》，但由于其使用的中性氧化铝需要进行复杂的活度调节和活性測试，使得实验过程繁琐且耗费时间长，对检验人员自身的实操经验有一定要求。本文旨在使用一种苏丹红专用的固相萃取小柱，开发辣椒粉中苏丹红含量测定的高效液相色谱分析方法。样品经正己烷提取，提取液浓缩后经专用的苏丹红固相萃取小柱净化，乙腈定容后上机分析。C18色谱柱，乙腈和水梯度洗脱，检测波长478nm、520nm。实验证明，四种苏丹红标准曲线线性关系良好，具有较好的回收率和精密度。

一、实验部分

1.仪器、试剂和耗材。Waters高效液相色谱仪（e2695）：配PDA检测器，梅特勒电子天平（ME403），昆山超声波清洗器（KQ-500DE），步琦旋转蒸发仪（R-300），IKA涡旋混匀器（天才3）；苏丹红Ⅰ（100μg/mL）、苏丹红Ⅱ（1000μg/ mL）、苏丹红Ⅲ（100μg/mL）、苏丹红Ⅳ（1000μg/mL）标准溶液均购自坛墨质检；乙腈、正己烷、二氯甲烷均为色谱纯试剂；实验用水为GB/ T？6682-2008规定的一级水；安谱苏丹红专用固相萃取小柱：500mg/6mL（活化方法：依次用5mL二氯甲烷和5mL正己烷活化小柱）。

2.色谱条件。液相色谱柱：TechMate？ C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈和水梯度洗脱（0-2min：乙腈85%+水15%；2-6min：乙腈95%+水5%；6-15min：乙腈95%+水5%；15-17min：乙腈85%+水15%；17-25min：乙腈85%+水15%）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量20μL；检测波长：478nm、520nm。采用色谱峰的保留时间定性，外标峰面积法定量。

3.标准溶液的配制。取苏丹红Ⅰ（100μg/mL）和苏丹红Ⅲ（100μg/mL）各1.0mL，苏丹红Ⅱ（1000μg/mL）和苏丹红Ⅳ（1000μg/mL）各0.10mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度混匀，得到浓度为10μg/mL的四种苏丹红混合标准溶液。准确移取不同体积的上述四种苏丹红混合标准溶液，用乙腈稀释配制成一系列的标准工作液。

4.样品处理。称取1g辣椒粉样品（精确至0.001g）于15mL离心管中，加入10mL正己烷，超声5min，过滤。用10mL正己烷洗掉残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL。浓缩液上固相萃取小柱，用2mL正己烷洗涤浓缩瓶，洗涤液也一并上样到小柱上。用5mL正己烷淋洗小柱，5mL二氯甲烷洗脱小柱。洗脱液在40℃下氮气吹干，用1.0mL乙腈定容，超声1min，漩涡混合10s，过0.45μm一次性有机滤器后上机测定。

二、结果与讨论

1.样品前处理条件的优化。苏丹红是一种亲脂性的化合物，使用正己烷作为样品中苏丹红的提取溶液并配合超声波萃取，可以很好地提取辣椒粉样品中的苏丹红。实验采用苏丹红专用的固相萃取小柱，方法简单快速，不需要对中性氧化铝进行复杂的活度调节和活性测试，整个前处理时间不超过1h；溶剂消耗少，国标GB/T？19681-2005使用60mL的丙酮正己烷溶液进行洗脱，本方法只用5mL二氯甲烷进行洗脱，不仅节约了实验成本，还减少了有机试剂对环境的污染。

2.色谱条件的优化。（1）检测波长的选择：经PDA检测器全波长扫描，发现苏丹红Ⅰ的最大吸收波长为478nm，苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的最大吸收波长均在520nm左右，因此PDA的检测波长确定为478nm和520nm。（2）流动相的选择：由于辣椒中含有大量色素等内源性干扰物质，基质成分极其复杂。使用高比例乙腈和低比例水相，虽然可以提高检测效率，但是这样的洗脱条件会造成目标物质和杂质共同流出的情况。因此，为避免杂质对目标分析物的干扰，实验优化了流动相洗脱条件，使用乙腈和水的梯度洗脱程序。

3.标准曲线和检出限。将配制好的系列苏丹红混合标准溶液上机分析，以峰面积对浓度绘制标准曲线，苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的线性相关系数均达到0.999以上，检出限均为0.01mg/kg。详见表1。