心力衰竭患者不同时期肠道菌群多样性分析

陈俊华, 张淳, 张存新△

中国人民武装警察部队新疆维吾尔自治区总队医院 1心内科, 2肾病科(新疆乌鲁木齐 830091)

心力衰竭(heart failure，HF)是各类心血管疾病的终末阶段，其患病率高、预后差，在世界范围内造成严重的医疗负担[1]。HF的病理生理机制涉及多个器官系统，这些器官系统通过神经激素、通路和促炎因子相互影响[2]。长期慢性HF使心排量降低，肠道充血、外周血管收缩，这种血流动力学改变导致肠道微循环障碍，从而引起肠道微生物组成的改变[3-4]。近来有研究表明，肠道菌群紊乱与HF之间存在一定联系，但其具体机制仍不清楚。本研究以同一HF患者不同时期和对照组为研究对象，利用高通量测序平台对研究对象的粪便进行定性分析，初步了解HF患者不同时期肠道菌群的变化，探讨肠道菌群在HF的进展、恶化中所起到的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 连续入选2018年1—12月在中国人民武装警察部队新疆维吾尔自治区总队医院心内科住院的HF患者45例(HF组)，男27例，女18例，年龄63～80岁，平均(72±6)岁；单纯合并高血压14例，高血压合并冠心病23例，单纯冠心病2例，单纯心脏瓣膜病3例，心脏瓣膜病合并冠心病3例；射血分数降低的HF(HfrEF)38例, 射血分数保留的HF(HfpEF)7例；所有观察组患者均因急性HF入院。选取同期入院合并相同HF危险因素但无HF病史及临床表现的患者30例为对照组，男18例，女12例，年龄61～78岁，平均(71±9)岁；单纯合并高血压6例，高血压合并冠心病15例，单纯冠心病1例，高血压合并冠心病及瓣膜病3例，单纯瓣膜病5例。

两组患者在年龄、性别、冠心病病史、心脏瓣膜病史、高血压病史、糖尿病病史、血脂紊乱、吸烟史等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性,见表1。所有患者均签署知情同意书。

1.1.1 纳入标准 (1)观察组纳入标准：急性HF诊断标准参考Framingham标准，主要标准：阵发性夜间呼吸困难、颈静脉怒张、肺部啰音、心脏扩大、急性肺水肿、第三心音奔马律、静脉压增高；次要标准：夜间咳嗽、活动后呼吸困难、肝肿大、胸腔积液、肺活量降低至最大肺活量的1/3、心动过速(>120次/min)；符合1项主要标准及2项次要标准者可确定急性HF诊断。(2)对照组纳入标准：每例患者至少合并1个HF危险因素(如高血压、冠心病、2型糖尿病、风湿性心脏病等)，无HF病史及临床表现。

项目对照组(n=30)HF组(n=45)t/2值P值年龄(岁)71±972±60.100.752性别[例(%)]0.020.914 男18(60)27(60) 女12(40)18(40)既往史[例(%)] 冠心病19(63.33)25(55.56)0.240.621 高血压病24(80.00)37(82.22)1.330.256 心脏瓣膜病8(26.67)13(28.29)1.180.366 糖尿病12(40.00)21(46.67)1.520.208 血脂紊乱18(60.00)28(62.22)1.380.251吸烟史[例(%)]13(43.33)19(42.22)1.160.367

1.1.2 排除标准 (1)急性冠脉综合征；(2)肾功能衰竭(血肌酐水平>265.2 μmmol/L)，严重肝功能损害(丙氨酸转氨酶大于正常上限3倍)；(3)恶性肿瘤患者；(4)急性炎性疾病、自身免疫性疾病、炎症性或吸收不良性肠病；(5)3个月内使用过任何抗生素、益生菌或益生元制剂。

1.2 方法

1.2.1 一般资料的采集 入选对象均进行标准评估，包括年龄、性别、病史、服药史、体格检查、心电图、血液学检查、X线胸片、心脏超声。收集观察组失代偿期、代偿期和对照组患者的清晨新鲜粪便5.0 g于无菌冷冻试管中，具体方法如下：让受试者将粪便排泄至干净的容器中，尽量避免尿液对样本的污染。采集排泄中后部的新鲜粪便，并尽量挖取中部内侧的粪便作为样本，采用Longsee粪便微生物基因保护液套装采集样本，该套装由采样器、采集管和3 mL保护液组成。其中的保护液能瞬间固化样本中的菌群，使样本的菌群种类和丰度不再变化，同时有效保护菌群DNA完整性。粪便标本封口后于1 h内送至实验室，称取2 g粪便置于-80℃超低温冰箱内保存。粪便标本采集在HF失代偿期和代偿期不同阶段分别进行。HF失代偿状态定义为HF症状加重，如呼吸困难、液体潴留、疲乏、需要立即静脉给予利尿剂或正性肌力药物。如果满足以下症状，被认为是HF代偿状态：呼吸困难、液体潴留症状改善，肺部啰音减少、停止静脉使用利尿剂或正性肌力药物，改用口服利尿剂。患者从入院到治疗后HF代偿状态之前这段时间定义为HF失代偿期(失代偿组)，把HF代偿后到出院这段时间定义为HF代偿期(代偿组)。射血分数<40%定义为HfrEF，射血分数>50%定义为HfpEF[5]。

1.2.2 药物治疗方法 所有患者均接受常规治疗，包括抗血小板聚集、降压、降糖、调脂、稳定斑块等药物治疗；观察组接受抗HF治疗，所有患者均为低盐低脂饮食，所有HF患者，如无禁忌证均使用ACEI/ARB及醛固酮受体拮抗剂螺内酯。

1.2.3 肠道菌群基因组DNA提取 将2.0 g新鲜粪便置于42.0 mL离心管，加入1管Glass Beads 和1.1 mL缓冲液NC1，旋涡均匀后于95℃水浴10 min，加入20 μL蛋白酶K于55℃水浴水解15 min后，以12 000 r/min离心1 min，取上清液于2.0 mL试管中加入100 μL缓冲液NC2，3 μL缓冲液NY1旋涡均匀1 min，加入1 mL缓冲液NP20旋涡均匀后至4℃冰箱放置5 min，以12 000 r/min离心1 min，取上清液2 mL加入450 μL缓冲液NC3和450 μL无水乙醇混匀，将吸附柱插入到2 mL收集管中，加入上述混合液于吸附柱中，以12 000 r/min离心1 min，弃液后加入500 μL缓冲液KB以12 000 r/min离心，弃液后加入600 μL DNA洗涤缓冲液，以12 000 r/min离心1 min，弃液后加入500 μL DNA洗涤缓冲液以12 000 r/min离心1 min，弃液，将吸附柱放入新的收集管中以12 000 r/min离心4 min，向吸附柱正中央悬空滴加100 μL洗脱液于65℃培养箱中5 min，以12 000 r/min离心1 min，洗脱DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱中备用。

1.2.4 PCI扩增 用5%琼脂糖凝胶电泳检测基因完整性，采用引物扩增微生物16S RNA V3区，上游引物为5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游引物为5′-GGACTACHVGGGAWTCTAT-3′。每20 μL扩增体系中含4 μL FastRfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物，0.4 μL FastPtu聚合酶。扩增条件：95℃预变性3 min，27个循环(95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min。

1.2.5 肠道菌群16S rRNA V3-V4区高通量测序 所有样本的16SrRNA V3-V4区的PCR产物在illuminaMiseq平台进行高通量测序，记录原始Pereads数目、去除嵌合体后有效序列数目、有效序列的平均长度、有效序列的GC百分比含量，并比较各组间有无差异。应用分析软件Vsearch 10.0、Qiime 1.9.1，将两条序列进行对比，末端重叠区进行拼接，去除拼接结果中含有N点序列，去除引物和接头序列,去除两端质量值<20的碱基，去除长度<200 bp的序列；将拼接过滤过后点序列与数据库进行对比，去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效序列后聚类成操作分类单元(OTU)，在97%的相似水平下的OTU进行生物信息学分析，3组共有927个OTU，得到每个OTU对应的物种分类信息。基于OTU分析结果，进行样本微生物α多样性分析。Sobs表示样本中观察到的物种数目；Shannon指数用来估算样本中微生物多样性，Shannon指数越大，说明菌落多样性越高；Simpson指数用来定量描述一个区域的生物多样性，Simpson指数越大，说明菌落多样性越低。Chao1指数使用Chao1算法估计菌落中OTU数目，Chao1指数越大代表物种总数越多。

2 结果

2.1 HF失代偿组和代偿组体格检查、生化指标及用药情况的比较 对HF失代偿期和代偿期心率、收缩压、谷丙转氨酶、脑肭利肽及β受体阻断剂的使用比较差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.2 各组α多样性比较 与对照组相比，HF失代偿组及代偿组的Shannon指数明显降低；代偿组的Shannon指数高于失代偿组，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，HF失代偿组及代偿组的Simpson指数明显升高；代偿组的Simpson指数低于失代偿组，差异有统计学意义(P<0.05)。3组的Sobs指数、Chao1指数均差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图1。

2.3 肠道菌群结构分析

2.3.1 3组菌群在门水平相对丰度比较 3组肠道菌群在门水平进行对比分析，物种相对丰度高的有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门。各组中拟杆菌门和厚壁菌门分布无差异；HF患者富含变形菌门和放线菌门，HF失代偿组和代偿组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；然而变形菌门和放线菌门在HF失代偿组和代偿组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.3.2 各组菌群在属水平相对丰度比较 在属水平上，与对照组相比，HF组双歧杆菌属、沙门菌属、弯曲杆菌属、志贺杆菌属、耶尔森菌属丰度增高，巨单胞菌属丰度降低。HF的短期治疗能降低弯曲杆菌属、志贺杆菌属的丰度。见表5。

项目HF失代偿组(n=45)HF代偿组(n=45)t/2值P值心率(次/min)88.2±26.869.2±9.72.3760.027收缩压(mmHg)135.6±25.6115.2±14.23.4520.001谷丙转氨酶(IU/L)86.5±17.252.2±8.90.9450.030内生肌酐清除率[mL/(min·1.73m2)]48.8±19.749.1±22.30.8520.425血红蛋白(g/L)122.6±13.8121.2±15.21.0230.345总胆固醇(mmol/L)4.6±1.34.5±1.10.8840.420低密度脂蛋白(mmol/L)4.1±0.84.2±0.70.6820.524脑肭利肽(pg/mL)2 566.0±86.61 026.0±74.33.4320.001射血分数(%)41.3±18.645.4±13.81.9920.052使用β受体阻断剂[例(%)]9(20.0)37(82.2)2.1960.034

多样性指数对照组(n=30)HF组对照组 vs 失代偿组对照组 vs 代偿组失代偿组 vs 代偿组失代偿组(n=45)代偿组(n=45)t值P值t值P值t值P值Sobs指数220.2±45.1184.7±51.4192.6±46.81.6670.1061.2900.2090.9880.324Shannon指数3.27±0.371.46±0.462.70±0.292.2610.0462.3810.0232.2050.037Simpson指数0.08±0.040.44±0.130.17±0.025.4320.0002.0150.0465.4320.000Chao1指数268.2±49.6241.9±61.3254.3±58.61.0940.2630.1420.1601.7460.082

注:A:各组Simpson指数比较;B:各组Shannon指数比较

项目对照组(n=30)HF组对照组 vs 失代偿组对照组 vs 代偿组失代偿组 vs 代偿组失代偿组(n=45)代偿组(n=45)t值P值t值P值t值P值拟杆菌门35.16±12.9434.80±11.2834.06±13.300.5310.6030.5980.5230.8470.462厚壁菌门45.72±18.4642.63±16.2144.20±19.861.0650.3301.2190.2641.1740.303变形菌门4.82±1.368.63±2.627.32±2.811.2920.0210.8540.0411.6620.110放线菌门2.30±0.035.23±0.065.08±0.041.6630.0121.2900.0231.0580.362

项目对照组(n=30)HF组对照组 vs 失代偿组对照组 vs 代偿组失代偿组 vs 代偿组失代偿组(n=45)代偿组(n=45)t值P值t值P值t值P值双歧杆菌属0.10±0.043.10±0.862.06±1.082.8990.0062.6420.0101.9920.056巨单胞菌属2.62±0.640.23±0.040.36±0.053.2200.0023.4230.0011.1860.320沙门菌属015.36±0.319.23±0.654.2030.0004.2030.0000.6030.652弯曲杆菌属1.30±0.3024.32±3.7413.26±5.124.2030.0004.2030.0002.3800.026志贺菌属1.65±0.2618.93±12.327.32±2.364.2030.0003.4320.0012.3810.021耶尔森菌属022.90±6.4821.36±3.514.2030.0004.2030.0001.6580.120

3 讨论

HF是大多数心脏疾病在终末期的转归。HF患者由于心输出量不足和外周血液重新分配，导致胃肠道组织血流灌注不足、肠壁水肿通透性增加，进而引起肠道菌群移位，肠道内多种微生物及其代谢产物通过受损的肠道黏膜屏障入血，诱发系统性炎症反应和免疫反应[6]。近年来，随着微生物代谢组学和宏基因组学的发展，肠道菌群组成及其代谢产物的改变与HF的关联得到了更深入的揭示。

3.1 HF对肠道菌群多样性及物种组成的影响 健康人体在肠道中存在着数以万亿计的微生物，其中绝大多数可被归类为厚壁菌门和拟杆菌门[7-8]。我们通过招募年龄、性别、所患与HF相似疾病的患者为对照组，入院后给予相同饮食、相同基本药物治疗、粪便准备，尽可能降低混杂因素。通过16S-rRNA扩增测序，发现与对照组相比，HF患者肠道菌群多样性明显降低；在门水平，放线菌门、变形菌门丰度增高；在属水平，双歧杆菌属、沙门菌属、弯曲杆菌属、志贺杆菌属、耶尔森菌属含量较高；而巨单胞菌属含量降低。Pasini等[3]研究也显示HF患者肠道致病菌包括志贺杆菌、沙门菌、弯曲杆菌属过度生长。实验室及临床研究显示，彭氏变形杆菌、弯曲杆菌、产孢梭菌在体外能把食物中的胆碱变成偏苯三酸胺(TMA)[9]，TMA在肝脏经单加氧酶氧化生成氧化三甲胺(TMAO)。Tang等[10]研究发现，HF患者空腹血浆TMAO水平显著高于健康对照组(分别为5.0和3.5 μmmol/L，P<0.01)，血浆TMAO高的患者血浆脑利钠肽水平(BNP)也更高。基础研究表明，高水平TMAO能进一步恶化HF的发展。Nagatomo等[11]发现，当体内TMAO升高时，导致左室射血分数进一步降低、血液循环中BNP水平增高、肺水肿及心肌纤维化加剧，进而导致HF的恶化。Organ等[12]发现，在HF模型小鼠的食物中加入TMAO，其肺水肿、心室重构均较健康小鼠加重，且BNP水平升高更明显。Koeth等[13]通过实验证明，TMAO可干扰胆固醇的转运和代谢、改变胆汁酸池的大小，促进动脉粥样硬化的发生，进而诱发心力衰竭等终末事件的出现。Chen等[14]发现TMAO可通过激活Nod样受体蛋白3(NLRP3)来诱导血管炎症反应。近期研究表明，TMAO水平增高能诱发钠水潴留，促进HF进一步进展[15]。据此我们推测，HF患者肠道菌群分布改变，条件致病菌增多，可能导致微生物相关代谢产物TMAO水平增高，从而加重HF的进展和恶化。

双歧杆菌有多种病理生理效应，包括减少肠道致病菌数量，调节宿主免疫，通过减少粪便氨浓度和降低肠道pH值改变肠道环境。吲哚酚酸盐(Indoxyl sulfate,IS)是目前研究最为广泛的对心血管系统有危害的蛋白结合尿毒素溶质，IS水平与炎症、内皮细胞功能受损、氧化应激及左室收缩功能受损等密切相关[16]。有报道显示，HF患者中双歧杆菌丰度和血浆IS呈负相关。口服双歧杆菌可减少血液透析患者中IS的浓度，可能通过抑制致病菌如大肠埃希杆菌，恢复肠道的有利环境[17]，据此我们估计HF患者中双歧杆菌丰度增高，可能对抗IS起到一定的保护作用。

3.2 HF不同时期的肠道菌群变化特点 在我们的研究中，HF代偿期的Shannon指数高于失代偿期，Simpson指数低于失代偿期，差异有统计学意义(P<0.05)，提示HF代偿期，菌群多样性有所恢复。HF的短期治疗能降低弯曲杆菌属、志贺杆菌属的丰度。Hayashi等[18]研究也显示，同一HF患者，代偿期和失代偿期相比，志贺菌丰度降低；且志贺杆菌菌落的丰度，包括产生TMA和吲哚的微生物来源的TMA裂解酶和色氨酸酶，与循环中TMAO和IS水平呈正相关。据此我们推测HF患者的短期治疗能减少致病菌的生成，随着各项综合治疗的进行及病程的自然进展，在患者的临床症状、心功能障碍逐渐好转的情况下，患者的肠道功能菌群的多样性、物种组成及肠道功能有恢复的可能，但肠道菌群的恢复时间、程度及与患者临床症状好转之间的相关性等仍有待进一步研究。

本研究具有一定局限性，研究为单中心、小样本研究。因为经费限制，未进一步对HF患者肠道菌群进行代谢组学的分析，未进一步阐述相关肠道致病菌与微生物源代谢产物的关系。我们期待国内开展多中心、大样本前瞻性随机对照研究，进一步阐述肠道菌群在HF的发生发展过程中的病理生理机制。