TAZ、DKK-1在激素性骨质疏松患者血清中的表达及意义

雷长喜, 王金虎, 万坚波

鹰潭市人民医院 1核医学科， 2检验科(江西鹰潭 335000)

激素性骨质疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)属于继发性骨质疏松，是一种主要由糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)引起的，以骨量减少、骨的微细结构破坏、骨强度下降、骨脆性增加为特征的，容易发生骨折的代谢性骨病，其发病率在骨质疏松症中已上升至第3位，仅次于绝经后骨质疏松及老年性骨质疏松[1-2]，对患者的生命健康造成严重威胁。转录联合激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)可与通路内转录效应因子YAP(yesassociated protein)共同参与Hippo信号通路，感知并响应生物力学信号过程，参与骨组织细胞增殖、分化、代谢等调控过程[3]。Dickkopf-1蛋白(DKK-1)属于富含半胱氨酸蛋白家族分泌蛋白，能结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6参与抑制Wnt信号转导通路，其含量与骨密度呈负相关，在骨相关疾病的新骨形成过程中发挥着关键作用[4-5]。虽然TAZ、DKK-1在骨的新陈代谢方面有很多研究，但在GIOP患者体内表达、调控情况的研究相对较少。因此本研究将通过检测GIOP患者血清中TAZ、DKK-1表达水平，探讨TAZ、DKK-1与GIOP发病中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年8月至2019年5月在本院收治的GIOP患者95例，根据30 d后骨折与否将其分为骨质疏松组(46例)和骨折组(49例)。其中，骨质疏松组：男24例，女22例；年龄27～85岁，平均(56.32±9.45)岁；体质指数23～28 kg/m2，平均(25.04±2.63)kg/m2。骨折组：男25例，女24例；年龄29～87岁，平均(58.53±10.04)岁；体质指数为22～29 kg/m2，平均(25.94±3.66)kg/m2。同期健康体检者(对照组)50例，男26例，女24例；年龄30～85岁，平均(57.59±9.97)岁；体质指数为23～28 kg/m2，平均(25.64±2.42)kg/m2。3组性别、年龄、体质指数差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

GIOP纳入标准：(1)符合国内诊断骨质疏松的标准[6]，即骨密度t值<-2.0SD；(2)激素治疗引发骨质疏松者；(3)经本院伦理委员会审核批准；(4)患者及其家属知情并签署纸质版知情同意书。

排除标准：(1)慢性肝肾病、心脏疾病、全身身免疫性疾病、感染性疾病等者；(2)降钙素、雌激素等影响骨代谢或影响TAZ、DKK-1水平的药物者；(3)原发性骨质疏松者；(4)依从性差、不能按时复诊者。

1.2 试剂与仪器 人TAZ、DKK-1酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(货号分别为：JK-SJ-36707、JK-EA01830)购自上海晶抗生物工程有限公司；双能X线骨密度测定仪(型号：OSTEOCORE2)购自法国迈迪公司；罗氏电化学发光分析仪及其试剂、校准品、质控品(型号：cobas e 601)购自瑞士罗氏公司。

1.3 血清中TAZ、DKK-1表达水平检测 清晨抽取GIOP患者及健康体检者空腹外周静脉血10 mL，4℃低温条件下3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清分成两份置于无菌Eppendorf管中，一份用于检测骨代谢标志物，另一份用于检测目的因子，-70℃低温冰箱中冻存备用。

从-70℃冰箱中取出样品，ELISA法检测患者血清中TAZ、DKK-1的表达水平，试验方法均按照相应试剂盒说明书进行。使用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值，根据标准液浓度与标准液吸光度结果绘制出标准曲线，并得出换算方程，计算TAZ、DKK-1的表达水平。

1.4 骨密度和血清中骨代谢标志物表达水平检测 使用双能X线骨密度测定仪检测受检者左髋部和腰椎的骨密度。从-70℃冰箱中取出样品，使用罗氏Cobas e 411电化学发光分析仪检测血清中总Ⅰ型胶原氨基端前肽(total procollagen type 1 amino-terminal propeptide，tP1NP)、N端骨钙素(N-MID osteocalcin，N-MID)、β-胶原降解产物(cross-linked C-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen，β-CTX)、总维生素D(vitamin D3，Vit-D)和甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)这5项骨标志物指标。

2 结果

2.1 3组血清中TAZ、DKK-1水平 3组TAZ、DKK-1水平差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，骨质疏松组、骨折组患者血清中TAZ水平明显降低(P<0.05)，DKK-1水平明显升高(P<0.05)；与骨质疏松组相比，骨折组患者血清中TAZ水平明显降低(P<0.05)，DKK-1水平明显升高(P<0.05)。见表1。

项目例数TAZ(pg/mL)DKK-1(ng/mL)对照组5076.36±15.461.32±0.12骨质疏松组4647.72±13.27*1.61±0.18*骨折组4937.39±11.89*△1.79±0.24*△F值108.37480.245P值0.0000.000

注：*与对照组比较P<0.05；△与骨质疏松组比较P<0.05

2.2 3组骨密度比较 3组左髋部骨密度、腰椎骨密度差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，骨质疏松组、骨折组患者左髋部骨密度、腰椎骨密度明显降低(P<0.05)；与骨质疏松组相比，骨折组患者左髋部骨密度、腰椎骨密度明显降低(P<0.05)。见表2。

表23组骨密度比较

项目例数左髋部骨密度腰椎骨密度对照组500.75±0.150.99±0.21骨质疏松组460.67±0.12*0.76±0.18*骨折组490.61±0.10*△0.62±0.17*△F值15.55449.028P值0.0000.000

注：*与对照组比较P<0.05；△与骨质疏松组比较P<0.05

2.3 3组血清中骨代谢标志物水平 3组血清中tP1NP、N-MID、β-CTX、Vit-D和PTH水平差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，骨质疏松组、骨折组患者血清中tP1NP、N-MID、β-CTX、PTH水平明显升高(P<0.05)，Vit-D水平明显降低(P<0.05)；与骨质疏松组相比，骨折组患者血清中tP1NP、N-MID、β-CTX、PTH水平明显升高(P<0.05)，Vit-D水平明显降低(P<0.05)。见表3。

项目例数tP1NP(μg/L)N-MID(μg/L)β-CTX(ng/mL)Vit-D(nmol/L)PTH(pmol/L)对照组5046.82±14.409.34±2.530.46±0.1271.26±22.474.35±1.16骨质疏松组4651.28±14.62*16.13±5.36*0.60±0.14*61.81±18.23*5.79±1.48*骨折组4960.46±18.31*△28.79±8.11*△0.72±0.14*△47.15±15.64*△6.61±1.85*△F值13.261143.30747.09020.12427.997P值0.0000.0000.0000.0000.000

注：*与对照组比较P<0.05；△与骨质疏松组比较P<0.05

2.4 GIOP患者血清中TAZ、DKK-1水平与骨密度的相关性分析 相关性分析结果显示，GIOP患者血清中TAZ水平与左髋部骨密度、腰椎骨密度均呈明显正相关(P<0.05)，DKK-1水平与左髋部骨密度、腰椎骨密度均呈明显负相关(P<0.05)。见表4。

表4 GIOP患者血清中TAZ、DKK-1水平与骨密度的相关性分析

2.5 GIOP患者血清中TAZ、DKK-1水平与骨代谢标志物水平的相关性分析 相关性分析结果显示，GIOP患者血清中TAZ水平与tP1NP、N-MID、β-CTX水平均呈明显负相关(P<0.05)，与Vit-D水平呈明显正相关(P<0.05)，与PTH水平相关性不明显(P>0.05)；DKK-1水平与tP1NP、β-CTX、PTH水平均呈明显正相关(P<0.05)，与N-MID水平相关性不明显(P>0.05)，与Vit-D水平呈明显负相关(P<0.05)。见表5。

表5 GIOP患者血清中TAZ、DKK-1水平与骨代谢标志物水平的相关性分析

2.6 GIOP患者血清中TAZ、DKK-1水平预测骨折的效能分析 GIOP预测是否发展为骨折，血清中TAZ水平的ROC曲线下面积为0.746(95%CI：0.647～0.845)，截断值为38.45 pg/mL，敏感度为57.1%，特异度为87.0%；血清中DKK-1水平的ROC曲线下面积为0.715(95%CI：0.611～0.819)，截断值为1.78 ng/mL，敏感度为51.0%，特异度为89.1%；两者联合预测曲线下面积为0.826(95%CI：0.741～0.910)，敏感度为65.3%，特异度为87.0%。见图1。

图1 血清中TAZ、DKK-1水平的ROC曲线分析

3 讨论

继发性骨质疏松症是由于药物或疾病等原因导致的骨量减少、骨脆性增加、骨微结构破坏的代谢性疾病[7]。临床上GCs应用非常广泛，在呼吸系统、自身免疫性、血液系统和肾脏等疾病中均有应用，据报道美国人群长期服用GCs率可达1%，大剂量GCs长期使用会引发不良反应，GIOP是其最严重的不良反应之一，使用者的骨折发生率可达30%～50%[8]。研究表明，GCs无最小安全剂量，但骨质疏松的风险会随剂量的增大而增大，对椎体等松皮骨的影响远大于皮质骨，因而椎体骨折的GIOP患者更加常见[9-10]。虽然GCs对骨量的影响可逆，但GIOP患者一旦骨折，则骨量无法恢复正常[11]。所以，研究GIOP患者对骨折的预后十分重要。

TAZ是Hippo通路下游靶基因，在成骨细胞中促进骨形成并抑制骨吸收[12]；在软骨细胞中下调软骨细胞增殖活性，促进软骨细胞成熟分化[13]；脱磷酸化后通过促进骨髓基质干细胞分化成成骨细胞，从而调节成骨特异基因骨钙素的表达，并激活成骨细胞分化过程中的重要通路Wnt/β-catenin通路等[14]，参与骨组织细胞的增殖、分化和代谢等过程。本研究结果显示，与对照组相比，骨质疏松组、骨折组患者血清中TAZ、Vit-D水平和左髋部、腰椎骨密度明显降低，tP1NP、N-MID、β-CTX、PTH水平均明显升高；与骨质疏松组相比，骨折组患者血清中TAZ、Vit-D水平和左髋部、腰椎骨密度明显降低，tP1NP、N-MID、β-CTX、PTH水平均明显升高。这表明随着疾病的发生及加重，骨密度降低，骨代谢水平均异常变化严重，GIOP发生率增加，且GIOP患者骨量减少的原因可能与TAZ水平较低有关。进一步研究发现，GIOP患者血清液中TAZ水平与左髋部骨密度、腰椎骨密度、Vit-D水平均明显正相关，与tP1NP、N-MID、β-CTX水平均明显负相关。这表明TAZ水平与骨密度、骨代谢标志物有紧密联系，并进一步验证了TAZ可能参与骨组织细胞的代谢过程。预后的ROC曲线下面积为0.746，截断值为38.45 pg/mL，敏感度为57.1%，特异度为87.0%。这提示TAZ水平在预测GIOP患者是否发生骨折方面具有一定价值。

DKK-1是Wnt信号转导通路的抑制剂，通过与Wnt蛋白的共受体LRP5/6结合，减少细胞膜上的LRP5/6，阻断Wnt信号向细胞内部的传递，从而改变破骨细胞和成骨细胞间的平衡，导致骨侵蚀，并抑制骨髓基质细胞分化为成骨细胞，及骨折后的修复和骨基质的矿化过程[15-16]。本研究结果显示，与对照组相比，骨质疏松组、骨折组患者血清中DKK-1明显上调；与骨质疏松组相比，骨折组患者血清中DKK-1水平明显上调；DKK-1水平与左髋部骨密度、腰椎骨密度、Vit-D水平均明显负相关，与tP1NP、β-CTX、PTH水平均明显正相关；预后的ROC曲线下面积为0.715，截断值为1.78 ng/mL，敏感度为51.0%，特异度为89.1%。这表明血清中DKK-1水平上调可能是GIOP发生的一个途径，与骨密度、骨代谢标志物相关性明显，对GIOP预后有较好的特异性。进一步研究结果显示，GIOP患者血清中TAZ、DKK-1水平联合预测曲线下面积为0.826，敏感度为65.3%，特异度为87.0%。提示与单个因子预测GIOP发展相比，两者联合预测能在保证特异性变化不大的基础上，大幅度提高曲线下面积和敏感度，对预后有更高的诊断价值。

综上所述，GIOP患者血清中TAZ水平表达明显下调，DKK-1水平表达明显上调，与GIOP的发展程度密切相关，且与骨密度、骨代谢标志物关系密切，对GIOP预后具有重要意义。但本研究未能结合患者激素治疗的时间一起分析。