不同缓冲溶液对BSA蛋白硝化和脂质过氧化的影响

张 燕，李 丽，冯席汶，刘 铭，孙 杨

（西华大学理学院，四川 成都 610039）

蛋白质硝化主要是指蛋白质中的酪氨酸硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)，是一种重要的蛋白质翻译后修饰。脂质过氧化是体内氧应激增强后发生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）氧化生物膜的过程。许多生理和病理状态下都能检测到3-NT的存在以及脂质过氧化的相关产物，多种疾病如心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病等的发生发展与它们密切相关[1-6]。

相关研究表明，某些因素如pH值、催化剂等也会影响蛋白质硝化和脂质过氧化。Herold等[7]发现在氧化肌红蛋白存在的情况下，酪氨酸硝化在酸性溶液介质中更能有效地进行。我们前期研究也发现不同形态的铁催化蛋白硝酸也有所差异[8]。可见，溶液的酸碱性、催化剂等多种因素会影响蛋白质酪氨酸硝化和脂质过氧化。

缓冲溶液对维持生物的正常pH值和正常生理环境起到重要作用。人体血液中以H2CO3-HCO3-在血液中浓度最高，缓冲能力最大，对维持血液正常的pH值起主要作用。Tris碱的碱性强，可以只用这一种物质配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液，加之Tris缓冲液对生物化学过程干扰很小；因此，该缓冲液目前在生物化学研究中使用得越来越多。磷酸盐缓冲液因其宽的pH范围以及受温度影响小的特点而成为生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂。Hepes缓冲能力较强，pKa值为7.55，几乎不受外界因素影响，并且不易形成缓冲剂-金属离子复合物，也是一种广泛应用的缓冲剂。但相关研究[9]表明，Hepes具有阻断阴离子通道、影响培养细胞生长、抑制平滑肌肌力等生物学效应，因此，用Hepes作为缓冲剂时，其生物学效应不可忽视。柠檬酸盐缓冲液主要成分为柠檬酸和磷酸氢钠，常用于免疫分析。

本文选择5种常用缓冲溶液（碳酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、Hepes缓冲溶液）来研究缓冲溶液对2种不同形态铁（EDTA-Fe(Ⅲ)和柠檬酸铁）催化H2O2-NO2-导致BSA蛋白硝化和脂质过氧化的影响，以此来探讨影响蛋白质硝化和脂质过氧化的因素。

1 材料与方法

1.1 试剂

牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA），亚硝酸钠（sodium nitrite,NaNO2），双氧水（hydrogen peroxide,H2O2），柠檬酸铁，EDTA-Fe(Ⅲ)，磷酸盐（phosphoric acid,PBS），盐酸萘乙二胺，三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA），硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA），正丁醇（n-butanol），碳酸钠，Tris-Base，磷酸钠，柠檬酸，Hepes(2-［4-(2-hydroxyethyl) piperazinyl］ethanesulfonic acid)。

1.2 硝基酪氨酸含量的测定

在pH ＞ 9.5的条件下，3-NT在430 nm处有最大吸收，因此可以依据吸收光谱来计算其浓度。具体操作如下：取1 mL 10 mg·mL-1的BSA置于10 mL容量瓶中，然后分别加入100 μL 4 mmol·L-1的EDTA（或柠檬酸铁）、100 μL 0.1 mol·L-1NaNO2、100 μL 0.1 mol·L-1H2O2，最后用不同缓冲溶液补充至刻度，摇匀。将容量瓶置于37 ℃恒温水浴锅中水浴 30 min，然后取4.0 mL反应液，加入400 μL 1 mol·L-1的NaOH溶液，摇匀后在430 nm处测定吸光度。

1.3 亚硝酸盐含量的测定

酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺作用生成重氮化合物，再与N-1-奈基乙二胺盐酸进行偶联反应，生成紫红色化合物，该化合物在550 nm处有最大吸收峰，可通过分光光度法比色测得[10]。具体步骤：取1.2中所述反应液3 mL，然后加入3 mL Griess试剂，混匀后常温反应15 min，然后在550 nm处测定其吸光度值，同时做NaNO2标准曲线。

1.4 脂质过氧化反应的测定

当生物膜中的多不饱和脂肪酸受到氧自由基的攻击就会引发脂质过氧化作用，由此形成脂质过氧化产物，如醛基（丙二醛，MDA）、氢过氧基等。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的一个重要检测指标，而以硫代巴比妥酸（TBA）方法测得的MDA含量已被广泛用作诊断组织伤害和脂质过氧化程度的指标。丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS），该化合物在532 nm处有最大吸收峰，由此可推算出脂质过氧化的程度[11]。取1.2中所述反应液2 mL，分别加入2 mL 20%三氯乙酸，5.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸。沸水浴中反应1 h，流水冷却后，加入8 mL正丁醇，迅速用力上下晃动30 s，静置片刻，7 000 r/min离心5 min后取上层澄清溶液，在532 nm处测定其吸光度值。

1.5 统计方法

试验结果显著性差异分析采用组间t检验法。当P＜0.05时，则认为2组数据有显著性差异；当P＜0.01 时,则认为2组数据有极显著性差异。

2 实验结果

2.1 不同缓冲溶液中硝基酪氨酸含量的比较

图1 不同缓冲溶液对BSA硝基酪氨酸浓度的影响

3-NT比较稳定，所以它可以作为检测细胞和组织损伤的一个生物标志[12-13]。不同缓冲溶液中，Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-对BSA硝基酪氨酸浓度的影响如图1及表1所示。从图1(a)及表1中可以看出，EDTA-Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-体系下，碳酸盐缓冲溶液中硝基酪氨酸含浓度最高，可达23.6 μmol·L-1，Tris-HCl缓冲溶液中硝基酪氨酸的浓度最小，仅为8.7 μmol·L-1；5种缓冲溶液中硝基酪氨酸浓度顺序为碳酸盐 ＞ Hepes ＞ 磷酸盐 ＞ 柠檬酸 ＞ Tris-HCl。从图1(b)及表1中可以看出，在柠檬酸铁-H2O2-NO2-体系下，碳酸盐缓冲溶液中硝基酪氨酸浓度最高，可达10.3 μmol·L-1；Hepes缓冲溶液中硝基酪氨酸浓度最低，仅为7.1 μmol·L-1。5种缓冲溶液中硝基酪氨酸浓度顺序为：碳酸盐 ＞ 磷酸盐 ＞ Tris-HCl ＞柠檬酸 ＞ Hepes。

表1 不同缓冲溶液中硝基酪氨酸的浓度

此外，我们发现，无论是在EDTA-Fe(III)还是柠檬酸铁催化H2O2-NO2-体系中，磷酸盐缓冲溶液中的硝基酪氨酸浓度都是最高的。另外，无论在哪种缓冲体系中，EDTA-Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-体系催化BSA发生蛋白硝化的能力均大于柠檬酸铁-H2O2-NO2-体系。

2.2 不同缓冲溶液中亚硝酸盐质量分数的比较

在生物体内，亚硝酸盐可被氧化成活性氮[14-15]，因此可通过测定其质量分数的降低值来反映氧化量。Fe(III)-H2O2-NO2-体系在不同缓冲溶液中亚硝酸盐质量分数如图2及表2所示。由图2可知，无论是在EDTA-Fe(III)还是柠檬酸铁催化H2O2-NO2-体系中，所有缓冲溶液中亚硝酸盐的质量分数均有所降低，且质量分数顺序均为：柠檬酸＞Tris-HCl＞碳酸盐＞Hepes＞磷酸盐。其中，在EDTAFe(III)催化H2O2-NO2-体系中，Hepes缓冲溶液及磷酸盐缓冲溶液中亚硝酸盐质量分数均较空白降低18%左右；在柠檬酸铁催化H2O2-NO2-体系中，Hepes缓冲溶液及磷酸盐缓冲溶液中亚硝酸盐质量分数也较空白组降低13%左右。实验结果说明，Fe(III)-H2O2-NO2-体系在这2种缓冲溶液中，亚硝酸盐最易被氧化。

2.3 不同缓冲溶液中脂质过氧化反应的比较

图2 不同缓冲溶液中亚硝酸盐质量分数的比较

表2 不同缓冲溶液中亚硝酸盐的质量分数

Fe(III)-H2O2-NO2-体系中，不同缓冲溶液对BSA脂质过氧化产物TBARS的影响如图3及表3所示。实验结果表明，无论是EDTA-Fe(III)-H2O2-NO2-体系还是柠檬酸铁-H2O2-NO2-体系，BSA在Tris-HCl缓冲溶液中发生脂质过氧化程度都最高，其脂质过氧化产物TBARS浓度可达2.2 μmol·L-1，柠檬酸缓冲溶液中最低，TBARS浓度仅为0.6 μmol·L-1。这 说 明，在Fe(III)-H2O2-NO2-体系中，BAS置于Tris-HCl缓冲溶液最易发生脂质过氧化。五种不同缓冲溶液中，BSA发生脂质过氧化程度顺序为：Tris-HCl ＞ 碳酸盐 ＞ 磷酸盐 ＞ Hepes ＞柠檬酸。这表明，缓冲溶液对BSA的脂质过氧化将产生一定的影响。

图3 不同缓冲溶液对BSA脂质过氧化产物TBARS的影响

表3 不同缓冲溶液中脂质过氧化产物TBARS的浓度

3 讨论

蛋白质硝化和脂质过氧化的程度会因一些外部因素如缓冲溶液、pH值、催化剂等的影响而有所差异[7-8,16]。为了进一步研究缓冲溶液对蛋白质硝化、脂质过氧化的影响，本文选用了碳酸盐、Tris-HCl、磷酸盐、柠檬酸、Hepes 5种常用的缓冲溶液，以Fe(III)-H2O2-NO2-体系造成BSA酪氨酸硝化及脂质过氧化，以此来探究缓冲溶液对蛋白质硝化和脂质过氧化的影响。

实验结果表明，EDTA-Fe(III)和柠檬酸铁均能有效地催化H2O2-NO2-体系导致BSA发生酪氨酸硝化和脂质过氧化，但在不同的缓冲溶液中，酪氨酸硝化及脂质过氧化的程度有所不同。对于蛋白质硝化，两种催化体系下，Na2CO3缓冲溶液的硝化程度都最高，这说明一定浓度的碳酸盐可能有助于蛋白质硝化的形成。其原因可能是因为CO32-在生理pH值下，能迅速的氧化双硫磷、DNA、RNA鸟嘌呤残基、金属蛋白和蛋白质残基，特别是色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，使得它们产生相应的基团[17-18]。对于脂质过氧化，无论在EDTA-Fe(III)催化作用下还是在柠檬酸铁催化作用下，5种缓冲溶液中BSA发生脂质过氧化程度顺序为：Tris-HCl ＞碳酸盐 ＞ 磷酸盐 ＞ Hepes ＞ 柠檬酸。在同一缓冲液中，EDTA-Fe(III)和柠檬酸铁催化BSA发生酪氨酸硝化和脂质过氧化程度也有所差异，这表明缓冲体系以及催化剂的选择对蛋白质硝化、脂质过氧化会产生很大程度的影响。

本文对影响蛋白质硝化、脂质过氧化的因素只做了初步研究，实验结果可为进行细胞或其他体外氧化实验提供一定的理论依据，但体内发生蛋白质硝化、脂质过氧化的环境是复杂的；因此，对影响蛋白质硝化、脂质过氧化的因素还有待进一步深入研究。