发酵石榴汁工艺优化及成分分析

马 嫄 ，殷晓翠，罗钰湲，李英凤，郭 睿，苏 凡，车振明，袁乙平，徐 娟

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.四川福能源生物科技有限公司，四川 成都 610031）

石榴(Punicagranatum L.)是石榴科石榴属植物的果实，富含多酚、黄酮、鞣质、花色苷等活性物质，具有抗氧化和预防癌症等多种保健作用[1-2]。目前以石榴为原料的发酵产品主要有石榴酒[3]、石榴醋[4]、石榴乳酸菌饮料[5-8]。研究[6-8]发现石榴汁经益生菌发酵后可保持较高的营养价值，具有较高的抗氧化活性。对于发酵石榴汁抗氧化活性成分的研究报道较多，但关于其香气成分的研究较少。

感官评价是评价食物质量的重要方法，而食物的感官特性描述上界限不明，具有不准确、不确定的重复性特点[9]。传统的感官评价法易受到品评人员主观因素的影响，使得评价结果不够准确和客观，误差较大[10]。模糊数学综合评判借助模糊数学的一些概念，应用模糊关系合成原理，将一些边界不清、不易定量的因素定量化、进行综合评价，在一定程度上消除了主观因素的影响，使结果更加科学、客观[11-12]，被广泛用于对猕猴桃汁[13]、果蔬脆片[14-15]、葛根酒[16]等产品的感官分析中，而在发酵饮品特别是石榴发酵饮品中的应用尚属空白。

本文以浓缩石榴汁为原料，复原后采用嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和酵母菌复合发酵，通过单因素和响应面实验结合模糊数学分析确定最佳发酵工艺，并对发酵石榴汁的香气成分进行分析，以期为石榴的精深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浓缩石榴汁由四川福能源生物科技有限公司提供；植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌（活菌数≥1.0×1010CFU/g）购于四川高福记生物科技有限公司；果酒专用酵母（SY）（活菌数≥1.0×109CFU/g）购于安琪酵母股份有限公司；甲醇、没食子酸、芦丁、福林酚等试剂（分析纯）购于成都科龙化工试剂公司；Trolox（≥98.0%）、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（≥97.0%）购于上海源叶生物科技有限公司。

UV-2 800型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；G154DWS型高温灭菌锅，上海赛海洋生物科技实业有限公司；A610型全自动折光仪，济南海能股份有限公司；PHS-320型pH计，成都世纪方舟科技有限公司；WF32-16mm型色差仪，深圳市威福光电科技有限公司；GCMSQP2010plus，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵石榴汁的制作

石榴浓缩汁→复原→巴氏灭菌→灌装→接种→发酵→过滤→成品。

主要工艺步骤：石榴浓缩汁与水按照1∶3.687 5的质量比进行复原，复原后经65 ℃处理20 min，装入经121 ℃、20 min高温灭菌的发酵罐中。冷却后，先添加质量分数0.02%的酵母菌，再在一定白砂糖液添加量、乳酸菌总接种量（植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1）、发酵温度和时间条件下发酵后经过滤得到发酵石榴汁，进行感官评定。

1.2.2 感官评定

评定小组由20名食品专业研究生和老师组成，男女比例1∶1，在每个样品实验中，小组成员被单独安置在感官实验室进行实验，评价发酵石榴汁的感官特性（色泽、滋味、气味、组织形态）。为了提高可信度，评价员在评价前12 h不喝酒、不吸烟、不吃辛辣等刺激性的食品，评价结束后不准讨论，评价下一样品前，用清水漱口并间隔5 min。评定标准[7]如表1所示。

1.2.3 模糊数学模型的建立

1.2.3.1 发酵石榴汁的因素集、评语集

本研究的因素集U={色泽u1、气味u2、滋味u3、组织形态u4}[10]；评语集V={优v1、良v2、中v3、差v4}，其中优（4分）、良（3分）、中（2分）、差（1分）[10]。

表1 发酵石榴汁的感官评分标准

1.2.3.2 权重的确定

权重集是评语集中各指标的重要程度的集合，每个评语集对应一个权重系数[10,16]。由5 位专业品评员根据品评经验及结果，给出权重模糊子集X={x1,x2,x3,x4}的隶属度，隶属度的数值在0～1之间(保留2位小数)，0为不重要，1为最重要[14]。将5位品评员给出的数据构成5行4列矩阵，归一化处理后将每个评价指标的权值取平均值，即得到评价指标模糊权向量a={a1,a2,a3,a4}[13,16]。

1.2.3.3 模糊关系综合评价集

利用模糊合成算子中的M（·，+）建立模糊综合评价模型[8,10]。模糊关系综合评判集Y=a×R，其中R为模糊评判矩阵，a为权重集。将综合评定结果中各个分量分别乘以其对应的分值，加和后得到每个样品的综合感官评分。

1.2.4 发酵工艺优化

1.2.4.1 单因素实验

选择质量分数为50%的白砂糖糖液添加量为12%（百分添加量的基准是复原汁的总重）、发酵温度28 ℃、乳酸菌总接种量3.0%（活菌数为1.23×107CFU/mL，植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1），考察不同发酵时间（12、24、36、48、60、72 h）对发酵石榴汁的影响。

选择发酵温度28 ℃、发酵时间48 h、乳酸菌总接种量3%，考察不同糖液（质量分数为50%的白砂糖糖液）添加比例（6%、8%、10%、12%、14%、16%）对发酵石榴汁的影响。

选择质量分数为50%的白砂糖糖液添加量12%、发酵时间48 h，乳酸菌总接种量3%，考察不同发酵温度（22、25、28、31、34、37 ℃）对发酵石榴汁的影响。

选择质量分数为50%的白砂糖糖液添加量12%、发酵温度28 ℃、发酵时间48 h、考察不同乳酸菌接种总量（1%、2%、2%、4%、5%、6%）对发酵石榴汁的影响。

按照上述条件进行发酵后，通过模糊数学感官评价对发酵石榴汁的品质进行分析得到最佳的单因素条件。

1.2.4.2 响应面优化

根据单因素实验结果，采用Design-Expert8.0.6软件，根据Box-Behnken试验设计，选择糖液添加量（A）、乳酸菌总接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个因素为响应变量，以模糊数学得到的感官评分为响应值进行四因素三水平响应面优化实验（见表2）。

表2 响应面实验因素水平设计

1.2.5 香气成分测定

香气成分分析：参考文献[8,17]的方法稍作修改，采用HS-SPME-GC-MS技术进行检测。取6 mL样品置于20 mL顶空瓶中，再加入2 g NaCl，然后用聚四氟乙烯隔垫密封。在45 ℃水浴平衡20 min，将已活化的萃取头插入顶空瓶中吸附60 min，进样口解析5 min，进行GC-MS分析。

GC-MS条件[8,17]：采用DB-17MS毛细管柱(60 μm×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至120 ℃，再以6 ℃/min 升至210 ℃，保持9 min，以25 ℃/min升至240 ℃，保持3 min。进样口和离子源温度分别为250 和230℃，氦气流速为1 mL/min，EI源能量为70 eV；质谱扫描范围m/z 为33～450。经过NIST谱库进行对比分析，并参考相关文献，对其进行定性分析（相似度≥80%）。

1.2.6 理化指标测定

pH测定：采用pH计测定；可溶性固形物含量测定（TSS）：参照Zou等[18]的方法，使用阿贝折射仪测定，以蒸馏水作为空白，结果以百分含量（%）计；可滴定酸含量测定（TA）：参照Varela-Santos等[19]的方法，采用pH电位法测定，模式选择pH 8.1；总酚含量测定：参照古小露等[7,20]的方法，采用Folin-Ciocalteau法测定；花色苷含量测定：根据Chen等[21]的方法，采用pH示差法测定；抗氧化活性的测定：参照古小露等[7]的方法，以DPPH自由基清除率的方法来评价；色泽的测定：采用色差仪测定。

1.3 数据处理

采用SPSS23.0软件进行数据处理和方差分析，采用Origin Pro8.6进行作图分析，采用Design-Expert8.0.6软件进行响应面试验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 发酵石榴汁感官评价

2.1.1 感官评价

20位感官评价者按照制定的感官评价标准及方法对在单因素条件糖液添加量12%、发酵温度28 ℃、乳酸菌总接种量为3%，发酵时间12 h下得到的石榴汁进行感官评价，品评结果见表3，对品评结果进行归一化处理得到模糊关系矩阵R单1。用同样的方法得到其他单因素条件下的模糊关系矩阵。

表3 单因素条件1的品评结果

2.1.2 评价指标的模糊权向量

5位专业品评员给出权重模糊子集M，并对其进行归一化处理(见表4)。得到模糊权向量a={0.16,0.24,0.41,0.19}。

表4 不同指标的隶属度及归一化处理结果

2.1.3 模糊综合评价模型

以R单1为例，确定其模糊综合评价模型Y单1。

同理可得其余的Y单2～Y单24模型：

2.2 单因素实验结果

2.2.1 最适发酵时间的确定

由图1可知，发酵时间从12 h到48 h时，感官评分升高，主要原因在于乳酸菌在适宜温度进行发酵，12～16 h 处于对数增值期，延长发酵时间，利用处于稳定期的乳酸菌进行发酵产酸，促进风味的提升；当发酵到48 h时，感官评分最佳，因此最适发酵时间为48 h。

图1 发酵时间对发酵石榴汁感官评分的影响

2.2.2 最适糖液添加量的确定

由图2可知，随着糖液添加量的增加，发酵石榴汁的感官评分呈现先上升后下降的变化。实验所用乳酸菌对蔗糖具有较好的利用效果，蔗糖添加量在培养过程中影响显著[26]。糖液浓度过低，微生物生长所需的碳源不足，影响微生物代谢，产酸量减少，影响其感官评分；继续增加糖液浓度，形成的高渗透压环境不利于微生物生长，从而导致乳酸等产物生成也受到影响[26]，因此选择12%作为最适糖液添加量。

2.2.3 最适发酵温度的确定

由图3可知，随着发酵温度的增加，感官评分呈现先升后降的趋势，28 ℃时感官评分最佳，酵母菌和乳酸菌代谢旺盛，产生的风味理想[24]；当温度过高时，发酵环境更适合乳酸菌生长，不利于酵母菌的生长代谢，同时乳酸菌发酵产酸，使得发酵液pH下降，影响产品的滋味[24]，因此选用28 ℃为最适发酵温度。

图2 糖液添加量对发酵石榴汁感官评分的影响

图3 发酵温度对发酵石榴汁感官评分的影响

2.2.4 最适乳酸菌总接种量的确定

由图4可知，随着乳酸菌总接种量增加发酵石榴汁的感官评分呈先上升后下降的趋势。增加乳酸菌的接种量可以使酵母菌发酵产生的乙醇和CO2减少，使产品风味更好[22-23]；而乳酸菌接种量过高，发酵会产生大量的乳酸抑制酵母菌和乳酸菌的生长，使发酵石榴汁的风味变差[7]。研究发现，当2种乳酸菌添加总量为3.0%，酵母菌添加量0.02%时，发酵石榴汁的感官品质最好，故选择添加1.5%的植物乳杆菌、1.5%的嗜酸乳杆菌和0.02%的酵母菌进行发酵。

2.3 响应面优化发酵条件

采用Design-Expert对发酵工艺参数优化实验的感官评分结果进行分析，实验结果见表5。对结果进行方差分析，结果见表6。

图4 乳酸菌接种量对发酵石榴汁感官评分的影响

表5 Box-Behnken试验设计及结果

表6 感官评分的响应面二次模型方差分析

发酵石榴汁综合感官评分的二次响应面模型和失拟项的F值分别为 32.97，4.19。由表6可知，模型极显著（P＜0.001）。各因素经过二次多项回归拟合后，得到综合感官评分（Y）与糖液添加量、乳酸菌总接种量、发酵温度和发酵时间4个因素的2次多项回归方程为：

从表6的方差分析可知，模型极显著（P＜0.001），失拟项不显著，优化结果可用。模型具有较好的拟合性，其R2=0.970 6，Radj=0.941 1。从因素A、B、C和D对综合感官评分的影响看，一次项A、C、D影响极显著（P＜0.001）；二次项A2、B2、C2、D2均极显著（P＜0.001）；交互项AB影响高度显著（P＜0.01），AD、BD影响显著（P＜0.05），表明各自变量对响应值的影响并非简单的线性关系，且因素之间存在交互作用。

根据回归方程，利用Design-Expert作因子间的响应面分析图，如图5、图6、图7所示，可直观反映糖液添加量和乳酸菌总接种量、糖液添加量和发酵时间、乳酸菌总接种量和发酵时间之间的交互作用对综合感官评分的影响。

对响应面结果进行优化分析得到石榴汁发酵的最佳工艺参数为：糖液添加量12.67%，乳酸菌总接种量2.68%，发酵温度27.47 ℃，发酵时间48.44 h，在此条件下得到的综合感官评分预测值为3.172分。采用优化后的工艺进行验证试验，考虑到操作可实施性，在糖液添加量12.0%，乳酸菌总接种量均3.0%，酵母菌接种量0.02%，于28 ℃发酵48 h，得到的发酵石榴汁综合感官评分为3.10±0.03分，预测值与实际值标准偏差为2.3%，接近预测值，表明预测模型可行。

2.4 发酵石榴汁成分分析

2.4.1 发酵石榴汁香气成分分析

图6 糖液添加量和发酵时间对综合感官评分影响的响应面和等高线

图7 乳酸菌总接种量和发酵时间对综合感官评分影响的响应面和等高线

表7 发酵石榴汁中挥发性香气物质及含量

对发酵石榴汁的香气成分进行分析，结果见表7。发酵石榴汁中共检测出38种挥发性物质，其中主要的成分是醇类（10种）和酯类（10种）。醇类、酯类物质的相对含量分别为35.75%和42.59%。发酵石榴汁的风味不是由单一香气成分形成的，而是由源于构成风味结构组分的醇类、酯类、酸类等相互协调作用而形成的[8]。醇类物质主要是酵母菌在发酵过程中产生的，都是呈香物质，其中苯乙醇（5.95%）表现为玫瑰香和风信子香味[8]，正丁醇（6.21%）表现为水果香[16]。酯类物质具有令人愉悦的花香和水果香气，对发酵石榴汁芳香的呈现有不可替代的作用[8,16]。在发酵石榴汁中检测出的酯类物质多为乙酯类，乙酯类化合物较多可能是因为存在大量乙醇的原因[25]。发酵石榴汁中的乙酸乙酯（21.97%）具有水果香味，己酸乙酯（1.20%）表现为草莓香、苹果香和茴香[15]，这些香气物质赋予发酵石榴汁水果香和花香。各物质间相互协调使发酵石榴汁的风味更加丰富。与醇类和酯类物质相比，发酵石榴汁中的醛酮类、酸类和烷烃类物质虽然含量较少，但对其风味的形成具有重要作用。如壬酮表现出橙子香味[8]，C6～C12的脂肪酸具有椰香和脂肪香（己酸、壬酸）[16]。发酵石榴汁中的醇、酯、酮、酸等组分协调作用构成了特殊的风味。

2.4.2 发酵石榴汁理化指标分析

对工艺优化后得到的发酵石榴汁进行理化指标分析，结果如表8所示。其总酚含量为（803.34±13.04） mg/L，花色苷含量为（41.30±1.11） mg/L，抗氧化活性为（225.29±4.74） μmolTrolox/L，表明所得的发酵石榴汁具有较优的品质。

表8 发酵石榴汁理化指标分析

3 结论

通过模糊综合评定结合响应面法对石榴汁发酵条件进行优化，得到最优的发酵条件为：糖液添加量12.0%、乳酸菌总接种量为3.0%、酵母菌接种量为 0.02%、发酵温度28 ℃、发酵时间48 h，在此条件下得到的发酵石榴汁呈砖红色，无沉淀，酸甜适宜、口感舒适，其综合感官评分值为3.10（满分4.0分），品质偏优。通过接种乳酸菌和酵母菌进行混菌发酵，得到的产品具有独特的乳酸口味和低酒精度。发酵剂复配能提高糖类转化利用率,促进糖酵解。酵母菌发酵产生乙醇，对发酵石榴汁的风味构成具有重要作用。且益生菌复配发酵可使石榴汁的抗氧化能力维持在较高水平，使发酵石榴汁的总酚、花色苷和抗氧化活性分别保持在803.34 mg/L、41.30 mg/L、225.29 μmolTrolox/L。发酵石榴汁中共检测到38种挥发性物质，主要是醇类和酯类物质，醇类物质以正丁醇、壬醇、苯乙醇、庚醇为主；酯类物质以乙酸乙酯为主，且乙酯类化合物较多；此外还检测出酮类、酸类物质，这些物质协调构成了发酵石榴汁的特殊风味。采用模糊综合评定法结合响应面优化石榴汁的发酵工艺参数并分析其香气成分对石榴发酵饮品的品质研究具有一定的实际意义，可为石榴的精深加工产品开发提供一定的理论依据。