临床分离产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌耐药性分析及相关基因研究

袁 星 蒋 斌 曹 雷

合肥职业技术学院医学院 安徽合肥 238000；①合肥市第八人民医院检验科

大肠埃希菌存在于正常人体的体表和各种腔道，也广泛分布在医院环境中。该菌虽属于正常菌群但常造成医源性疾病，特别是肺炎、创面感染、泌尿道感染、脑膜炎和菌血症等[1]。十多年来大肠埃希菌呈现逐年增高的耐药率变迁趋势，且已出现多重耐药株。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lac-tamases，ESBLs)是一类能水解青霉素类、一至三代头孢菌素类及单环类抗生素，且能被ESBLs抑制剂(如棒酸、舒巴坦等)抑制活性的广谱ESBLs[2-3]，亦是大肠杆菌对β-内酰胺类抗菌素耐药的主要内在机制。因为ESBLs的基因型较为复杂多变，各种基因型对抗菌素的敏感性也不尽相同，另外表达ESBLs的大肠埃希菌流行情况随着年代、时间和地区的不同而异，临床感染治疗的效果也就各不相同。因此检测临床分离的表达ESBLs大肠杆菌的耐药情况和基因型分布，可为临床规范使用抗菌素、监控院内感染和流行病学方面的追踪调查提供较为有价值的参考依据。本研究收取了2018年本院分离培养出的136 株大肠埃希菌，针对其耐药谱及ESBLs耐药基因分析结果如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 合肥市第八人民医院由各临床科室2018年1～12月送检的各种标本中分离培养出136 株大肠埃希菌，去除相同患者多次获取到的相同菌株。编码为ATCC25922的大肠杆菌作为标准菌株。各种相关耐药基因的阳性对照细菌，包括标准产ESBLs大肠埃希菌(TEM26)，均由安徽医科大学第一附属医院检验中心供给。

1.2抗菌药物及培养基 本研究使用抗生素有：环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、头孢哌酮/舒巴坦(CSL/SCF)、氨曲南(ATM)、头孢曲松 (CRO)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、氨苄西林/舒巴坦(AMP/SCF)、头孢唑啉(CZO)、头孢吡肟(FEP)、头孢西丁(FOX)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、美罗培南(MEM)、亚胺培南(IMP)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB)、庆大霉素(GEN)、呋喃妥因(NIT/FT)、复方新诺明(SXT)，以上药敏纸片和水解酪蛋白琼脂( Mueller-Hinton Agar ，MH)平板均购于杭州滨和微生物制品公司，药片批号20170930～20180819。

1.3细菌鉴定及产酶株确认 依据卫健委《全国临床检验操作规程》第4版的分离程序鉴定细菌[4]，鉴定应用的全自动微生物分析仪为法国梅里埃生物公司的VITEK-2；采用药敏纸片增强法行产酶表型确证，即棒酸若能促使CAZ及CTX纸片中任一种的抑菌圈直径增大超过0.5厘米，即可确认为产ESBLs菌株[5]。

1.4药敏试验 细菌对抗生素的体外敏感试验使用K-B 纸片琼脂扩散法，结果判别依据美国临床实验室标准化研究所(CLSL/2013版)标准进行[5]，药敏结果分析使用由WHO细菌耐药监测中心推荐的Whonet-5.6软件。

1.5PCR反应和电泳所用试剂TaqDNA聚合酶，各碱基核苷混合物dNTP Mixture，10×PCR Buffer，DNA Marker，6×Loading Buffer，双蒸水等产品均从大连宝生物公司购置。本实验室自备了Tris Acetate-EDTA buffer (TAE)缓冲液。

1.6PCR引物 参考Genbank业已公布的数据库信息，由上海生工生物工程公司设计并合成各相关耐药基因引物序列，见表1。

表1 PCR检测基因引物序列和目的产物长度

1.7细菌模板DNA的制备 提前配制好浓度为200g/L的蛋白酶K溶液400L置于专用微量离心管中，挑取约3～5个菌落加入其中并混匀，先用56℃温育2小时，再置95℃煮浴10分钟，然后用相对离心力(RCF)为1000～1200克即约13000r/min离心2分钟，最后将上清液置于-20℃。

1.8细菌基因检测 利用一系列信息，采用基因PCR扩增的方法检测各产ESBLs菌株耐药基因 ，如CTX-M、TEM、SHV和OXA等基因。采用50L PCR体系对各种基因进行反应，试剂有：模板3L，10×buffer(Mg2+plus)5L，rTaq酶(5mU/L)0.25L，dNTP Mixture(各2.5mM)4L，引物1(20mM)1L，引物2(20mM)1L，加双蒸水35.75L，合计50L。循环扩增CTX-M1基因的参数为：93℃预变性2分钟，93℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸60sec，循环35个周期，72℃保温5分钟；其他基因按照产物片段长短等因素对循环扩增的参数适当变更。产物凝胶电泳使用1.5%琼脂糖，观察结果用凝胶成像分析仪，出现的目标条带若与阳性对照分子位置相当则为阳性。调整电脑的Bio-Rad GelDoc XR凝胶成像系统，将其设置至最好状态，再拍照、存档。

1.9统计学方法 采用统计学分析SPSS 17.0软件进行数据处理，计数资料以例(%)表示，组间率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大肠埃希菌对抗生素耐药表型分析与比较 2018年从临床标本中一共检出136株大肠埃希菌，其中81株为产ESBLs大肠埃希菌，占比为59.6%。药敏结果显示大肠埃希菌对青霉素、头孢菌素类、单环酰胺类和其他抗菌药物的耐药性较高，尤其是产ESBLs大肠埃希菌；产ESBLs大肠埃希菌对AMP、CZO、CTX、CRO、FEP和ATM的耐药率均达到了90%以上；对CAZ、SXT、LVX和CIP的耐药率也较高，均大于70%；产ESBLs大肠埃希菌株对MEM、IMP、NIT/FT、AMK、TZP和CSL/SCF的耐药率较低，各为0.0%、1.2%、9.9%、11.1%、12.3%和13.6%。大肠埃希菌对常用抗菌药物耐药率分析与比较,见表2。

表2 136株大肠埃希菌对常用抗生素的药敏试验结果及产酶与否菌株耐药性比较

2.2耐药基因PCR扩增结果 81株产ESBLs大肠埃希菌通过 PCR扩增发现，57株菌获得了CTX-M基因产物，占比达70.4%(57/81)，且36株菌获得466bpCTX-M9基因产物，达到了44.4%(36/81)；20株菌获得了1075bp TEM基因产物，阳性率达24.7%(20/81)；其余4株菌(4.9%，4/81) 获得了混合型的基因产物；但未检出SHV和OXA型菌株的基因产物，大肠埃希菌相关耐药基因产物电泳图见图1、图2，基因型分析见表3。

图1 产ESBLs基因CTX-M1和CTX-M8的PCR检测产物

图2 产ESBLs基因CTX-M9和TEM的PCR检测产物

表3 产ESBLs大肠埃希菌基因型构成比

3 讨论

大肠埃希菌感染率呈现逐年上升趋势，已引起微生物学工作者和临床医生的高度关注。本研究于2018年1～12月的临床标本中共检出大肠埃希菌136株，其中有81株为产ESBLs菌株，占比为59.6%，参照过去数据表明近年来产ESBLs的大肠埃希菌检出率有一定程度的升高。按患者所属的科室大体分布为重症监护病房、泌尿科和康复科，其原因可能有患者存在基础疾病较重、年龄大、住院时间长、免疫力较低、抗生素过度使用等情况。

β-内酰胺类抗生素是当前临床上最常使用的抗生素之一，然而，这类药物在临床上大量、广泛应用之后，细菌对其耐药状况亦日趋严重。中国医院细菌耐药监测网资料显示，大肠杆菌对头孢菌素类药物耐药率均较高[6]。大肠埃希菌的耐药率与区域性、地方性和不同医院有关，本院该菌对青霉素、头孢菌素、ATM、SXT、氨基糖苷和氟喹诺酮类药物的耐药率较高，而对碳青酶烯类、NIT/FT、AMK和含酶抑制剂的复合药物耐药率较低，例如对MEM则全部敏感。结果还显示， ESBLs阳性细菌对头孢类和其他常用抗生素的耐药率普遍大于ESBLs阴性细菌，两相比较差异具有统计学意义；而这两类细菌对于MEM、IMP、NIT/FT、GEN和TOB来说，耐药率虽有高低之分，差别却没有统计学意义，说明细菌耐药率的变迁是一个从量变到质变，逐渐积累才形成较为明显变化的过程。

产ESBLs是大肠杆菌对β-内酰胺类抗菌素耐药的决定性机制。其中耐药基因类别较多，比如CTX-M、TEM、SHV和OXA型和其他不常见的基因型。表达ESBLs的细菌表现为全球广泛性流行，不过各个国家、地区和各级医院检出的产ESBLs基因型和亚型构成比不尽相同，其中以CTX-M、TEM、SHV型较为常见。加拿大学者研究结果表明，大肠杆菌中具有CTX-M 型占70.9%，SHV 型占3.6%，TEM型占2.2%[7]。国内学者报道大肠杆菌中CTX-M型构成比则高低不等，本研究数据显示表达ESBLs大肠杆菌中CTX-M型为70.4%，高于贵州省的数据(35.5%)[8]，低于其他地区相关报道[9]。TEM型和SHV型比例较低(24.7%及0%)，和国内文献报道相比(TEM型为59.6%～86.3%，SHV型为3.5%～27.5%)而言，反映了本医院ESBLs流行的基因型情况。本研究中基因型构成比表明，兼具CTX-M与TEM 两个基因型的菌株占4.9%，由分子机制揭示出了表达ESBLs致病菌所含耐药基因的复杂多变性。

当前，CTX-M 型按其同源性被划分为5组(群)，每个组包含对应的亚型。在各个时期和各个地区，CTX-M 各组和亚型分布情况不尽相同。本研究结果显示出了类似的分布特征，CTX-M9组为44.4%(36/81)， CTX-M1组为18.5%(15/81) ，而CTX-M8组只有7.4%(6/81)，与国内的相关报道基本一致[10-11]。本研究SHV和OXA型基因测定结果均为阴性，是否和引物序列设计、反应体系环境、样品大小或参数调整相关，还是由于当前含有SHV和OXA的菌株并不常见，应该做进一步的研究与探索。一般而言，多数 CTX-M 型ESBLs降解CTX与CRO能力强于降解CAZ，本研究的药敏试验结果也说明产ESBLs大肠埃希菌对CAZ的耐药率比前两者稍低。因为不同组别各亚型降解特性有所不同，CTX-M1组和CTX-M9组菌株对FEP、CAZ和AMT的耐药率表现出一定的差别[12]。考虑到产ESBLs大肠杆菌的耐药基因型流行情况过于复杂与多变性，并且表现出了地区性流行的特点，所以各个地方必须对本区域菌株实施监控，从而为该菌感染性疾病的防控、诊断与治疗提出充实的理由。

由于产ESBLs大肠埃希菌的耐药基因由质粒介导，质粒也可携带针对喹诺酮类药物耐受的基因qnr。相关整合子或者转座子上的基因可以通过接合、转化和转导等方式在细菌之间相互传递、共享，从而导致大肠埃希菌对CIP和LVX等氟喹诺酮类抗菌药物耐药率较高，且出现一定的上升趋势；但是碳青霉烯类抗菌素对ESBLs高度稳定，故产ESBLs大肠埃希菌对该类抗菌素极为敏感；又因为ESBLs能被ESBLs抑制剂(例如棒酸、SCF和TZP等)抑制活性，故产ESBLs大肠埃希菌对该类复合抗菌素较为敏感；至于对AMK、NIT/FT也敏感，可能与该类药物的肾毒性等副作用限制了它们在临床上的广泛使用，导致细菌的抗菌素选择性压力较低有关。本研究中，药敏试验的相关结果也证实了以上几点。

总之，对大肠埃希菌耐药性进行持续监测，深入探讨细菌耐药性的分子机制，这对于阻断该菌突变途径，减少耐药菌株的传播，研发新的抗菌药物，都具有坚实的理论和实践意义。