TLR4基因rs7873784单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性关系

李唯源 张 志 李 昂 付 宁 宋琴琴 刘 冲 吕 澜 张浩良 张雪梅

华北理工大学附属唐山工人医院肿瘤内二科 河北唐山 063000；①华北理工大学生命科学学院

肝癌是目前全球常见的癌症类型之一，发病率高且病死率也在逐年上升[1]。2015年我国癌症统计数据显示，肝癌发病率为9.42%，位居第4位，病死率为13.94%，位居第2位[2]。研究表明肝癌的发生发展与多种因素相关：包括黄曲霉毒素B暴露，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染，烟酒过量，铁超载和糖尿病[3]。单核苷酸多态性(SNPs)作为一种常见的人类可遗传的变异，与癌症易感性密切相关[4]。Gao J等研究表明，个体的遗传变异影响肝癌的发生发展[5]。

TLR4作为Toll样受体(TLRs)家族重要的信号通路之一，可通过SNPs影响癌症的风险。国内外多项研究显示：TLR4基因在宫颈癌[6]、皮肤癌[7]、胃癌[8]、肝癌[9]等多种恶性肿瘤中发挥作用。rs7873784G>C位于TLR4基因3’UTR端，乔艳等[10]通过病例对照研究发现TLR4 rs7873784变异与结直肠癌易感性相关，携带GC/CC基因型个体较携带GG基因型个体结直肠癌的发病风险降低。该位点与肝癌易感性关系暂无涉及。本研究采用成组设计的病例对照研究方法，探讨TLR4基因3’UTR端rs7873784 G>C变异对肝癌发病风险的影响，为临床提供更多潜在预防和治疗策略。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2011～2015年在华北理工大学附属唐山工人医院和华北理工大学附属唐山市人民医院经病理检查确诊的原发性肝癌患者240例纳入观察组，均未接受过放化疗及靶向治疗且无其他恶性肿瘤病史。随机选取同期在唐山地区且与观察组无血缘关系的体检健康者500例为对照组。采取查阅病历资料和问卷调查方法收集研究对象一般人口学资料及临床病理资料。本研究经院伦理委员会批准(编号:20190321)。

1.2DNA提取 抽取研究对象外周静脉血2mL，使用天根生化科技(北京)有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(DP318)提取DNA，提取物置于-20℃冰箱保存。

1.3基因型分析 利用TaqMan-MGB探针法进行基因分型TaqMan-MGB探针序列：ContextSequence(VIC/FAM):TCATGTACTAGTGAAAGTAGATGTG(C/T)GCATTTGTGCACATAT。PCR反应在ABI 7900HT Fast Real-TimePCR仪中进行。反应体系含TLR4 rs7873784探针0.065μL，基因组DNA 1μL(0.1～20ng)，2×PCR mix(TaqManUniversal Master Mix Ⅱ，Applied Biosystems ABI)2.0μL，加水补足至5μL。反应条件为：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，60个循环。使用ABI SDS 2.4软件进行结果判断和分析。每个检测单元均设立阴性对照及两个以上随机重复样本进行质量控制。

1.4统计学方法 采用SPSS 23.0(Version 23.0；IBM，NY，USA)进行数据分析。研究对象性别、年龄和吸烟状况基本特征分析均采用χ2检验。采用Pearson拟合优度检验验证对照组是否符合Hardy-Weinberg遗传定律。采用非条件Logistic回归分析基因遗传变异与肝癌易感性的关系，以比值比(OR)及其95%置信区间来表示相对危险度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组基本资料的比较 其中观察组男188例(78.3%)，女52例(21.6%)；对照组男374例(74.8%)，女126例(25.2%)。两组性别、年龄和是否吸烟比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。对TLR4 rs7873784对照进行拟合优度检验，该SNP位点符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，该研究人群具有代表性。

表1 两组研究对象基本资料比较[例(%)]

2.2TLR4 rs7873784基因多态性与肝癌易感性的关系 为探索TLR4 rs7873784基因型分布与肝癌易感性的关系，对研究结果进行分析，表2显示，观察组中TLR4 rs7873784GG基因携带者222(92.5%)例，GC+CC基因携带者18(7.5%)例，对照组中TLR4 rs7873784GG基因携带者424(84.8%)例，GC+CC基因携带者76(15.2%)例，经非条件Logistic回归分析，相比于TLR4 rs7873784 GG基因型携带者，至少携带一个C等位基因者可能会降低肝癌发病风险(OR=0.45，95%CI=0.26～0.77，P=0.004)。

表2 TLR4 rs7873784G>C遗传变异与肝癌风险关系的分析[例(%)]

2.3TLR4rs7873784G>C遗传变异与肝癌易感性关系分层分析 为进一步探讨TLR4rs7873784遗传变异与肝癌发病风险之间的关系，本研究对性别、年龄和吸烟进行分层分析，见表3。

表3 TLR4 rs7873784G>C遗传变异与肝癌发病风险的分层分析

在性别分层中，与TLR4 rs7873784G>C GG基因型相比，GC+CC基因型可减少男性患者肝癌发病风险(P<0.05)，但在女性患者中无明显差异(P>0.05)。

年龄分层显示，在>60岁年龄组中，TLR4rs7873784至少携带一个C等位基因者较GG基因型携带者具有较低的肝癌发病风险(OR=0.34，95%CI=0.14～0.85，P=0.021)，而在≤60岁年龄组差异无统计学意义(P>0.05)。

吸烟分层显示，与TLR4 rs7873784G>C GG基因型相比，至少携带一个C等位基因型的非吸烟组降低了肝癌的发病风险(OR=0.27，95%CI=0.16～0.59 ，P=0.001)而在吸烟组中并不影响肝癌发病风险(P>0.05)。

3 讨论

TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白的天然免疫模式识别受体，可以识别外源性以及组织衍生的促进炎症的分子信号[11]。TLR4作为TLRs家族至关重要的信号通路之一，可以识别胞外抗原，对胞内损失相关因子产生应答，通过SNPs影响癌症的发展和转移[12]。研究表明[10]，TLR4 rs7873784 G>C变异影响hsa-let-7d-3p及hsa-let-7e-3p与TLR4基因3’，UTR之间的互补结合，抑制癌症的发生。Jin Y等研究发现在我国汉族人群TLR4 rs7873784-G等位基因携带者患宫颈癌风险明显高于C等位基因型的携带者[13]，TLR4 rs7873784遗传变异影响宫颈癌发病风险。

本研究发现，TLR4 rs7873784至少携带一个C等位基因较GG基因型携带者显著降低肝癌发病风险，Zi-Cheng Jiang等研究发现[14]，TLR4 SNPs影响肝癌易感性，与本研究结果一致。研究发现：年龄和性别为肝癌发生和发展的危险因素[15]，本研究通过性别分层分析发现，TLR4 rs7873784 GC+CC基因型携带者较GG基因型携带者显著降低了男性肝癌发病风险。这可能与男性职业和社会关系等有关，使得其更易暴露于肝癌危险因素中，也可能与男女间激素水平差异有关[16]。通过年龄分层发现，在>60岁年龄组中TLR4 rs7873784 GC+CC基因型携带者较GG基因型携带者降低肝癌发病风险，表明年龄和TLR4 rs7873784G>C遗传变异可能共同影响肝癌易感性。另研究发现长期大量吸烟, 使亚硝胺、芳香胺等多种致癌物质长久作用于肝脏，导致肝癌的发生[17]。本研究表明在非吸烟者中TLR4 rs7873784G>C至少携带一个C等位基因者较GG基因携带者罹患肝癌的风险显著降低。

本研究表明，TLR4 rs7873784G>C至少携带一个C等位基因能够降低肝癌发病风险，实验结果为TLR4 rs7873784G>C作为肝癌治疗可能的潜在靶点提供理论依据，但仍需结合最新的理论成果及肝癌其他危险因素并在更大样本量的人群中进一步研究证实。