三叉神经痛模型大鼠的三叉神经节中JAK/STAT3通路的活化

张 瑶，刘亚军，李 芳，朱大卫，王元银，侯爱兵

JAK激酶/信号转导和转录激活因子信号STAT3转导通路是一条从膜到核的信号转导通路，能在多种病理生理过程发挥重要作用[1]。其主要由JAK蛋白酪氨酸激酶和STAT3蛋白连接蛋白两部分组成，能在细胞因子诱导下被活化从而调节目的基因的表达[2]。JAK/STAT3通路能在许多细胞类型中被与损伤反应有关的细胞因子激活，因此在疼痛信息的传递和调节中发挥着重要作用[3]。神经性疼痛的发展也伴随着炎症成分的释放，可引发神经损伤并由各种信号通路传递信息从而引发更加广泛和持久的效应，这些均可能使疼痛过敏增强[4]。脊神经损伤(建立脊神经缩窄动物模型)后脊髓中有pSTAT3、白介素(IL)-6、IL-1β蛋白的表达上调，而在给予JAK/STAT通路抑制剂后IL-6、IL-1β的表达则明显减低并伴随机械痛敏的减弱[5]，提示JAK/STAT通路在神经性疼痛的免疫炎症反应中有着重要作用。而有关三叉神经痛(trigeminal neuralgia, TN)模型大鼠的三叉神经节(trigeminal ganglion, TG)中有无JAK/STAT3通路的活化尚无研究涉及，因此该研究旨在通过成功建立大鼠TN模型，使用Western blot、免疫荧光方法检测pSTAT3在TN大鼠TG中的变化情况，为探讨有效的TN治疗方法提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取体质量为120 g左右的成年雄性SD大鼠，常规饲料饲养，自由饮水进食，室内环境温度控制在20～25 ℃，12 h交替照明。造模前对所有大鼠进行Von Frey毛刷的刺激训练练习，在每日基本固定的时间段内(避免在下午5点以后进行，否则大鼠比较活跃测量不准确)交替刺激大鼠双侧触须垫区域约6次，刺激间隔30～60 s，持续3～5 d后记录每只大鼠在此期间的平均机械阈值，剔除对刺激异常敏感(<0.6 g)及过于迟钝(>1.8 g)的大鼠，使得最后选出用于造模的大鼠健康且对一定机械强度下的刺激反应平静，依照动物伦理学的原则进行所有的动物实验和处理。实验所用大鼠均来自安徽医科大学实验动物中心。

1.2 实验模型建立将32只雄性SD大鼠按照随机分组的原则将其分成2组，即假手术组(Sham组)16只，眶下神经缩窄组(CCI-ION组)16只。称重后，按照每100 g体质量给予0.38 ml 10% 水合氯醛的比例对大鼠行腹腔注射麻醉。待麻醉显效后，将大鼠放置于消毒铺巾后的操作台上，对拟操作的术区用0.5%碘伏消毒，沿大鼠左侧颧骨下缘胡须垫区稍偏内侧做约5 mm长的手术切口，纹氏钳略扩大手术切口后向下钝性分离组织，用玻璃分针轻柔的显露出约3 mm长度的眶下神经，注意操作轻柔，最后用5-0号线在相距2～3 mm处分别结扎眶下神经使其轻微压迫，缝合皮肤创口并涂抹金霉素软膏预防感染；对于Sham组行手术切口的部位及前期方法相同，而在玻璃分针显露出眶下神经后不予以结扎，仅缝合皮肤切口并涂抹金霉素软膏完成造模。最后分别将Sham组与CCI-ION组模型大鼠置入不同的鼠笼中并备注相应标签后继续常规饲养。

1.3 实验模型验证使大鼠在安静环境下稳定15 min后，用Von Frey毛刷从最小的刺激力度开始依次增大刺激大鼠的术侧胡须垫区进行检测，每个刺激力度的检测需重复6次，每次间隔30 s，直至大鼠出现以下阳性反应：逃避或攻击以及不对称的面部搔抓行为中的至少1项，此时记录下出现阳性反应的最小刺激力度即为机械敏感阈值。实验大鼠分别在术前和术后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d时记录阈值并统计分析。

1.4 Western blot法检测pSTAT3蛋白含量将未行任何手术操作的Naive大鼠和建模后第3、7天的大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射过量麻醉致死，遂立即于冰上分离取出术侧TG并编号称重，于冰浴的玻璃匀浆器内按照1 mg组织加入10 μl RIPA裂解液的比例在剪碎神经节后进行研磨，待无肉眼可见大块组织后，于4 ℃、12 000 r/min的条件下离心30 min；取上清液按照比例加入蛋白上样缓冲液，于100 ℃条件下加热10 min使蛋白充分变性，最后置于-20 ℃冰箱内储存备用。上样行SDS凝胶电泳后将目的蛋白转移到PVDF膜上，TBST溶液漂洗3次每次约5 min后，将PVDF膜置于5% 脱脂牛奶中室温下封闭1 h。用一抗稀液稀释一抗(pSTAT3-Tyr705：1 ∶10 000，美国Abcam公司，货号ab76315；GAPDH: 1 ∶10 000，美国 Bioworld公司，货号AP0063)，随后将PVDF膜置入并于4 ℃摇床孵育过夜。将充分漂洗后的PVDF膜置于已稀释好的二抗中室温孵育1 h。最后将漂洗后的膜置于显影机内设置条件曝光成像，采用Image J图像处理系统分析目的蛋白的相对表达水平。

1.5 免疫荧光实验将Sham组大鼠与建模后第2天的CCI-ION大鼠用前述方法取出术侧TG后于4 ℃冰箱内梯度脱水固定TG(分别置于4%多聚甲醛溶液中20 min, 10%蔗糖溶液、20% 蔗糖溶液中各2 h, 30%蔗糖液中过夜)，取出后用组织包埋剂于-20 ℃环境下包埋TG，在冰冻切片机上切片后于-20 ℃冰箱内保存待用，取出的冰冻切片复温15 min后于PBS中洗胶后用配置好的含有山羊血清的PBST封闭液于室温条件下封闭2 h，充分漂洗后将按照比例稀释后的一抗加于组织玻片上[pSTAT3-Tyr705：ab76315，1 ∶100；兔抗GFAP：ab7260，1 ∶1 000；兔抗NeuN：ab177487，1 ∶300；鼠抗CD11b(ITGAM)：ab8878，1 ∶200)(美国Abcam公司)；鼠抗pSTAT3-Tyr705：#4113，1 ∶100(美国Cell Signaling Technology公司)]，置于4 ℃冰箱内孵育过夜后取出，漂洗残余的一抗孵育液后用封闭液稀释二抗(山羊抗小鼠IgG/TRITC(ZF0313)、山羊抗兔IgG/FITC(ZF0311)：1 ∶100，北京中杉金桥科技有限公司)，室温下暗箱内避光孵育2 h后于PBS液中漂洗，避光黑暗环境下滴加防荧光淬灭液后置盖玻片固定，并放置于-20 ℃冰箱内避光保存待用。

1.6 统计学处理采用 SPSS 17.0软件进行分析，行为学实验结果和Western blot结果采用重复测量设计的方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学实验结果Von Frey毛刷测定结果显示CCI-ION组大鼠的机械敏感阈值明显低于Sham组大鼠。术后第1天CCI-ION组大鼠机械敏感阈值即开始降低[Sham组：(1.55±0.22)g，CCI-ION组：(0.35±0.21)g]，在第14天时疼痛阈值达到最低[Sham组：(1.53±0.04)g，CCI-ION组：(0.10 ±0.04)g，F=25.13，P<0.05](图1)。

图1 各组大鼠触须垫在造模后不同时间点机械敏感阈值的变化

2.2 pSTAT3蛋白在TG中的表达变化Western blot结果显示，CCI-ION组大鼠TG中pSTAT3蛋白相对表达量在术后第3、7天时较Sham组大鼠均明显增高，差异有统计学意义(F=64.37，P<0.05)。见图2。

图2 pSTAT3蛋白在 CCI-ION 组大鼠术侧TG中的表达变化

2.3 pSTAT3蛋白的免疫荧光表达及其定位在术后第2天的术侧TG内，CCI-ION组大鼠可见大量的pSTAT3绿色荧光(图3A2)而在Sham组大鼠pSTAT3标记的绿色荧光则很少(图3A1)。在分别行pSTAT3与GFAP(卫星胶质细胞标志物)、ITGAM(小胶质细胞标志物)、Neun(神经元细胞标志物)的免疫荧光双染实验后发现，在术后第2天，pSTAT3仅与ITGAM有大量的共染(图3B3中表现为黄色的共染区)，而与GFAP无共染(图3C)，与Neun亦无共染(图3D)，提示活化的pSTAT3定位于小胶质细胞内。比例尺均为50 μm。

3 讨论

TN是一种严重的慢性疼痛综合征，在三叉神经的一个或多个分支的口面部区域内出现严重的、短暂的、阵发性的电击样疼痛，常由接触“扳机点”引发，发病率为4%～13%[6]。目前其具体发病机制尚不完全清楚，周围致病因素认为是TG及脑桥区的异常压迫引起的，而中枢发病机制理论则认为TN是一种感觉性癫痫样发作[7]。针对其完全有效的理想治疗方法尚未被发现，现阶段对TN的经典治疗手段主要是卡马西平、奥卡西平等抗癫痫药，但是治疗后复发率仍较高[8]。因此阐明TN的有关分子生物学发病机制对进一步探究其有效的治疗方法是必需的。

用CCI-ION术建立TN模型是由Vos et al[9]于1994年首次提出的一种经典的造模方法，其能有效模拟出TN的自发性疼痛及痛觉过敏两大方面，其中大鼠胡须垫区的机械阈值测定是判断造模有无成功的标准。近年来，研究[5]显示STAT3通路的活化参与了外周神经损伤后脊髓内痛觉信息的传递和调节。此外，在糖尿病神经性痛及奥利沙铂引发神经性疼痛的大鼠模型中亦观察到JAK/STAT3通路的活化[1,10]。神经系统中胶质细胞是除神经元外的第二大主要成分，外周神经系统(PNS)中的胶质细胞主要由卫星胶质细胞、施万细胞和小胶质细胞组成[11]。本研究中CCI-ION术后第2天的免疫荧光实验发现pSTAT3定位于TG中的小胶质细胞上，这与Dominguez et al[5]在脊神经损伤模型中的观察结果相似。然而，有报道[12-13]表明，除了小胶质细胞外，上调的pSTAT3还存在于其他类型的细胞中，这种差异可能是由于行实验检测的时间点不同或取材标本不同引起。

图3 术后第2天的术侧TG内pSTAT3的免疫荧光表达及其定位

本研究由CCI-ION术建立大鼠模型，结果表明，在术后第14天的机械阈值检测中，CCI-ION组较Sham组均明显降低，提示TN模型建立成功。同时，Western blot实验结果表明，CCI-ION后术侧TG的pSTAT3蛋白相对表达量明显增加。在Dominguez et al[14]的研究中，脊髓内pSTAT3的免疫荧光表达在术后24～48 h时最高，因此本实验选用术后第2天(术后48 h)作为免疫荧光的检测时间点。结果表明CCI-ION组的术侧TG中有大量的pSTAT3荧光染色，而Sham组仅可见很少的pSTAT3荧光染色。这些发现可能为TN的治疗及相关分子机制研究提供了新的方向。