牙龈卟啉单胞菌PrtC蛋白体外表达、纯化及功能初探

高晓雪，汪 颖，夏 荣

牙周炎是一种由细菌感染引起的牙周支持组织破坏的慢性进行性疾病[1]。牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)被认为是牙周病主要致病菌之一[2]。P.gingivalis能够分泌多种毒力因子，产生多种胞外蛋白酶，如牙龈素、胶原酶、肽酶等，可对牙周组织产生破坏[3]。蛋白酶可以降解多种蛋白质和多肽底物，破坏牙周组织细胞，诱导与组织破坏、骨吸收相关的致炎细胞因子的产生[4]。而PrtC蛋白正是这些蛋白酶中的一种。

1992年，Kato et al[5-6]发现胶原酶PrtC来源于牙龈卟啉单胞菌ATCC53977，能够降解I型胶原蛋白，在牙周组织的破坏和牙周病的发展过程中发挥重要作用。然而有研究[7]表明prtC基因编码的产物不能降解胶原的底物以及没有与真核动物胶原酶相似的Zn2+结合区域，因此对其是否是真正的胶原酶地位提出了质疑。该研究以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277PrtC蛋白为研究对象，通过原核表达体系，体外表达出PrtC蛋白，并验证其是否具有降解胶原的功能，以期获得较好的蛋白质晶体为将来设计分子药物提供结构基础。

1 材料与方法

1.1 材料包含prtC基因全长的PUC57克隆质粒(上海生物工程技术服务公司合成)；PCR引物(南京擎科生物科技有限公司合成)；克隆载体p29(美国Invitrogen 公司的pET29b载体改造)；PCR试剂盒(美国Promega公司)；DNA回收试剂盒(上海华舜生物工程公司)；镍离子亲和层析、预装柱凝胶过滤层析HiLoad 16/60 Superdex 200(美国GE Healthcare公司)；DNA测序(上海生物工程技术服务公司)；无抗性Top10 菌株及克隆、质粒扩增选用无抗性 BL21(DE3)(美国Invitrogen 公司)；胶原蛋白I型(美国Solarbio公司)；抗His标签抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG (美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1prtC基因的生物信息学分析 利用Protparam软件对PrtC蛋白序列进行理化性质分析，包括氨基酸组成、分子量、半胱氨酸的个数等，并利用ProtScale软件分析基因表达产物各氨基酸的亲水性/疏水性，应用Multalin interface page进行序列比对，BLAST预测其结构域。

1.2.2prtC基因分子克隆 全基因合成牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的prtC基因序列(AP009380.1)，密码子优化后用CloneExpress同源重组方法构建质粒。在设计引物时要设计目的基因以及载体线性化的引物，目的基因的正反向引物要和载体的线性化引物有15～20 bp的同源序列，这样可以在重组酶ExnaseⅡ的催化下发生同源重组。Primer5软件设计prtC基因引物，上游引物:5′-AAGAAGGGAGATATACATATGAAAGAAATGAACGTGAAT-3′；下游引物:5′-GTGGTGGTGGTGCTCGAGTTCTTCACG TTTATCGAAACGG-3′。p29载体线性化上游引物：5′-CTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3′，下游引物：5′-ATGTATATCTCCCTTCTT-3′。PCR扩增外源基因片段后，通过凝胶电泳确定PCR产物并利用PCR清洁试剂盒进行产物回收。p29载体线性化产物使用DpnI酶在37 ℃水浴下处理2 h，并在重组酶ExnaseⅡ作用下将目的基因片段与线性化处理载体进行连接。转化到Top10感受态菌株，进行菌液PCR检测。依据核酸电泳结果选取菌液 PCR中呈阳性的菌液进行测序。

1.2.3PrtC蛋白的小量原核表达检测和大量表达纯化 将构建成功的重组质粒分别转入 BL21(DE3)和 pKY206(DE3)感受态细胞中，其中大肠杆菌表达菌株BL21添加了T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计的，而表达菌株pKY206带有质粒表达分子伴侣，能够帮助蛋白质折叠。分别在 37 ℃和16 ℃条件下诱导表达4 h和20 h。将上清液和沉淀分别制蛋白样，进行SDS-PAGE检测。按照表达检测摸索的蛋白最佳表达条件，进行扩大培养。将扩大培养后收集到的菌块，使用预冷的缓冲液A(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，14 mmol/L β-MER, 1 mmol/L EDTA-Na2，5% glycerol pH7.5)进行超声破碎，12 000 r/min离心后用40 mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱杂蛋白，最后用400 mmol/L咪唑缓冲液B(20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，14 mmol/L β-MER，1 mmol/L EDTA-Na2，5% glycerol pH7.0)洗脱目的蛋白并收集，在缓冲液B的环境中上样至分子筛Superdex 200，收集蛋白样品，使用SDS-PAGE分析。

1.2.4Western blot鉴定纯化的PrtC蛋白 切取纯化PrtC重组蛋白的SDS-PAGE所需条带，250 mA、60 min转印至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉摇床上37 ℃封闭1 h，TBST洗膜3次；加入1 ∶2 000稀释的抗His标签抗体为一抗，37 ℃孵育1 h。洗膜后加入1 ∶3 000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育45 min。ECL底物发光显影定影试剂盒显色，使用X线曝光分析结果。

1.2.5PrtC蛋白胶原酶功能实验 将蛋白稀释到1 mg/ml，eppendorf 离心机12 000 r/min、4 ℃离心10 min，吸出转移至干净灭菌EP管中。称取3 mg胶原蛋白溶于1 ml TES buffer。分别设置五个时间梯度(10、14、18、24、32 h),反应体系设为10 μl。将胶原蛋白、PrtC蛋白各自的对照组,胶原与PrtC蛋白混合的实验组同时放入30 ℃恒温水浴反应直到实验结束后，加入1 μl的EDTA-Na2终止反应，再加入5×loading buffer，制取蛋白样，10%SDS-PAGE鉴定。

2 结果

2.1 PrtC蛋白的生物信息学分析结果prtC基因编码的蛋白质包含417个氨基酸,分子量为47 ku，理论等电点为6.2，有9个Cys。应用ProtScale Server进行亲水性/疏水性预测，多肽链第100、103位的I、D亲水性最强(-2.378)，第404位的R疏水性最强(1.800)，其亲水性氨基酸数目多于疏水性氨基酸(图1)。Multalin interface page序列比对结果显示，来源于牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的PrtC氨基酸序列比ATCC53977在N端多出83个氨基酸残基，相似度为72.4%(图2)。BLAST预测其有两个结构域，分别是N端蛋白酶U32家族(Peptidase_U32 superfamily)结构域(10～362位)，推测其可能为胶原酶的催化结构域，C端翻译因子(Translation_Factor_Ⅱ_)结构域(331～402位)(图3)。

图1 亲水性/疏水性预测结果

2.2 PrtC蛋白表达载体的构建以PUC57质粒载体为PCR模板，PCR扩增得到约1 251 bp的目的片段，p29载体线性化扩增到约5 370 bp，其大小均与预期值相符(图4)。通过重组酶体系将载体和基因片段连接后，转化到感受态Top10。挑取单克隆，菌液PCR结果(图5)，阳性结果显示测序正确。

2.3 PrtC蛋白的小量表达检测和大量表达纯化从SDS-PAGE结果中明显可见目的蛋白表达，在45 ku上方有一条蛋白条带,其大小与PrtC蛋白的分子量相符。由于大肠杆菌表达菌株pKY206分子伴侣与目的蛋白大小相近，会产生干扰，因此选择BL21表达菌株16 ℃这个条件进行扩大培养。见图6。将重组质粒p29-prtC 转化到表达菌株BL21，培养后使用0.2 mmol/L IPTG 诱导重组蛋白表达。使用400 mmol/L咪唑缓冲液A经镍柱把目的蛋白洗脱下来,电泳结果见图7，由SDS-PAGE可知目的蛋白的纯度大于95%。

图2 不同菌株PrtC蛋白序列比对

图3 结构域预测

图4 PCR扩增结果

图5 菌液PCR

使用分子筛Superdex200进行纯化，A280吸收监测显示：目的蛋白PrtC峰型对称，出峰位置在65 ml，通过标准曲线(Velution=289.8-43.2×logMr)计算出PrtC蛋白在分子筛上显示出的分子量是160 ku，PrtC单体的分子量是47 ku表明PrtC蛋白以三体形式存在于溶液中。但分子筛出峰较宽，表明蛋白状态较好，可用于晶体学研究(图8)。

图6 PrtC表达检测SDS-PAGE分析

图7 PrtC镍柱亲和层析蛋白电泳图

图8 分子筛Superdex200 16/60 GL的A280吸收峰

2.4 Western blot鉴定纯化的PrtC蛋白PrtC重组蛋白经过在大肠杆菌体内破碎离心、Ni2+柱亲和层析，洗脱液中得到被纯化的6×His-PrtC重组蛋白。以鼠抗His Tag单克隆抗体为一抗，进行Western blot检测，其结果显示了纯化的蛋白为PrtC重组蛋白(图9)。

图9 Western blot结果

2.5 PrtC蛋白胶原酶功能实验结果由10% SDS-PAGE可知，随着时间的增长，实验组PrtC蛋白加入胶原蛋白溶液后,在32 h胶原蛋白的条带变得非常的浅，而且在35 ku可见一条带，推测可能是胶原蛋白发生降解产生。而作为对照组的PrtC蛋白和胶原蛋白从实验开始就放入30 ℃水浴锅直到结束，它们的条带几乎没有变化，也没有出现降解条带，因此证明PrtC蛋白具有降解胶原蛋白的能力(图10)。

3 讨论

P.gingivalis是一种革兰阴性厌氧杆状细菌，已从晚期成人牙周炎的病变中分离出来。prtC基因序列是来自于已经被完全测序的全基因组牙龈卟啉单胞菌ATCC33277菌株[8]，而牙龈卟啉单胞菌ATCC53977这个菌株的全基因组序列并没有测序完成。生物信息学分析：PrtC蛋白的氨基酸序列中大部分为亲水性氨基酸，可获得可溶性表达。来源于牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的PrtC蛋白氨基酸序列比ATCC53977的氨基酸序列在N端多出83个残基，第133～163位氨基酸组成有明显不同，尽管ATCC53977被证明有胶原酶活性，但ATCC33277是否有此功能，还没有研究证实。BLAST发现PrtC蛋白有两个结构域，分别是蛋白酶U32家族和翻译因子，可见N端的U32蛋白酶家族结构域保守，是蛋白酶活性中心。蛋白酶U32家族中第一个被解析的结构是来自于甲烷嗜热菌中的基因mk0906编码的蛋白酶U32结构域，揭示U32蛋白酶结构域是一个TIM-桶状结构,该蛋白的四级结构是个二聚体。序列比对发现Mk0906与牙龈卟啉单胞菌序列的相似性低于20%，所以Mk0906不能降解I型胶原蛋白[9]。并且也有研究[10-11]表明P.gingivalis可以通过影响宿主细胞基质金属蛋白酶(MMP)的表达、激活和抑制来诱导宿主胶原降解。研究人员提出PrtC蛋白可能与P.gingivalis或宿主细胞的脂多糖或MMP产生的其他因子联合作用，在牙周炎的发生发展过程中起作用[12-13]。因此对prtC基因产物在胶原分解活性中的作用提出了质疑[14]。本实验初步证明PrtC蛋白能降解I型胶原蛋白，后续将通过同位素标记的方法继续验证胶原酶降解胶原的功能。本研究同样也使用了微流控晶体初筛机器人(Mosquito),进行了晶体的初筛，没有发现晶体形成,于是将PrtC蛋白氨基酸序列与其他物种中的同源蛋白的氨基酸序列进行比对，结果显示这些序列非常保守，只有N端的几个氨基酸序列同源性较低，后期考虑设计N端的截短版、加配体等方法筛晶体。

图10 PrtC蛋白酶解SDS-PAGE

本研究将prtC基因连接到p29质粒，得到的重组质粒能够表达含6×His标签的重组蛋白。将重组质粒转化到表达菌株大肠杆菌BL21，使用IPTG诱导表达重组蛋白，然后再用镍柱亲和层析法、分子筛层析(Superdex 200)预装柱纯化，Western blot验证目的蛋白。通过胶原酶功能实验，初步证明牙龈卟啉单胞菌ATCC33277PrtC蛋白能够将Ⅰ型胶原蛋白降解。由于目前没有人解析PrtC蛋白的晶体结构，而本实验中也没有得到蛋白晶体，所以将继续尝试使蛋白的状态更好，更稳定、均一，为得到蛋白晶体并解析结构，了解其在牙周病发生中致病机制和研制临床药物提供理论基础。