LncRNA RMRP靶向调控miR-613对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

张英 东丽

乳腺癌是全球第二大常见的恶性肿瘤。据报道，全球每年约有167万乳腺癌新增患者，占所有癌症患者的11.88%[1]。然而，乳腺癌的发生发展的机制尚未完全阐明。近年来，随着分子生物学的快速发展，基因治疗已成为肿瘤研究的热点，探讨与乳腺癌相关的癌基因或抑癌基因为乳腺癌的临床诊疗提供了新的方向[2]。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究发现，LncRNA参与调控包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展[3,4]。线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA组分(RMRP)是一种LncRNA，其最早发现于常染色体隐形遗传性疾病软骨发育不全中[5]。研究证实，RMRP在神经母细胞瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中表达失调，沉默RMRP抑制神经母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[6,7]。Park等[8]研究发现，RMRP在乳腺癌患者组织中表达上调，但RMRP在乳腺癌方发生发展中的机制并未完全阐明。因此，本研究通过体外细胞实验旨在探讨RMRP对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其作用机制，以期为临床乳腺癌的诊疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 正常乳腺细胞HBL-100和4种乳腺癌细胞(SK-BR-3、BT-549、MCF-7和MDA-MB-231)购于美国ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素双抗溶液购于Hyclone公司；LipofectamineTM 2000相关转染试剂和TRIzol试剂购于Invitrogen公司；MTT细胞增殖检测试剂盒和western blot相关试剂购于碧云天公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝公司；si-RMRP、si-con、miR-con、miR-613 mimics、pcDNA-con、pcDNA-RMRP、anti-miR-613、anti-miR-con、WT-RMRP和MUT-RMRP的构建和测序均由北京华大基因公司提供；Cyclin D1抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体均购于Abcam公司；Cyt-c抗体购于深圳子初生物技术有限公司；β-actin抗体购于Santa Cruz公司；HRP标记的二抗购于武汉博士德生物技术有限公司。

1.2 细胞培养、转染和实验分组 采用含有10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基于37℃、含5% CO2、湿度饱和的细胞培养箱中分别培养HBL-100、SK-BR-3、BT-549、MCF-7和MDA-MB-231细胞。细胞转染：按照每孔2×105个细胞的密度将对数期的MCF-7细胞接种于6孔板，当细胞汇合度约为60%时，用不含血清培养基同步化12 h后进行转染。将si-RMRP或si-con(miR-613 mimics或者miR-con)溶解于Opti-MEM培养基，室温孵育5 min，同时另取LipofectamineTM 2000加入到Opti-MEM培养基室温条件孵育5 min，然后将两者混合后室温放置20 min，最后将含si-RMRP或si-con(miR-613 mimics或者miR-con)的混合物分别加入到MCF-7细胞中，培养6 h后，更换为DMEM培养基继续培养48 h后进行后续实验。分别命名为si-RMRP组、si-con组、miR-613组和miR-con组。NC组为正常培养的MCF-7细胞。为进一步证明RMRP是通过调控miR-613表达进而影响MCF-7细胞的增殖和凋亡，将si-RMRP和anti-miR-613同时转染入MCF-7细胞，检测MCF-7细胞的增殖和凋亡情况。命名为si-RMRP+anti-miR-con组和si-RMRP+anti-miR-613组。

1.3 qRT-PCR检测 利用TRIzol试剂分别HBL-100、SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231细胞和各组MCF-7细胞的总RNA。利用逆转录试剂盒合成cDNA，并按照说明书以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。用2-ΔΔCt法计算RMRP和miR-613的相对表达量，分别以β-actin和U6为内参。引物序列如下：RMRP上游引物5’-ACTCCAAAGTCCGCCAAGA-3’，下游引物5’-TGCGTAACT-AGAGGGAGCTGAC-3’，β-actin上游引物3’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，β-actin下游引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，miR-613上游引物5′-AGGAATGTTCCTTCT-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，U6上游引物5’-GATTTCTCCCTCATCGCT-TACAG-3’，下游引物5’-CTGCTTCATGATCGTTGTTGCTTG-3’。

1.4 双荧光素酶报告基因检测 利用TargetScan进行靶基因预测发现，RMRP与miR-613存在连续结合位点，猜测miR-613和RMRP存在靶向关系，并利用双荧光素酶报告基因检测实验进行验证。构建野生型WT-RMRP和突变型MUT-RMRP的RMRP-3’UTR荧光素酶报告基因载体，利用LipofectamineTM 2000将miR-613mimics和miR-con分别与WT-RMRP或MUT-RMRP同时转染入MCF-7细胞，培养48 h后，测定各组细胞的荧光素酶活性。

1.5 MTT法检测细胞活力 分别取各组对数生长期细胞，胰酶消化后按照每孔2×103个细胞数(100 μl)接种于96孔板，培养48 h后加入MTT试剂(20 μl/孔)，孵育4 h后，弃去孔内上清液，向每孔加入DMSO试剂(150 μl/孔)，继续孵育2 h直至结晶完全溶解。酶标仪测定490 nm处各孔的OD值。并按照公式计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰蛋白酶消化各组MCF-7细胞，离心收集细胞后用PBS漂洗2次，加入适量的结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度约为1×106个/ml。每管加入100 μl细胞，再向管中加入5 μl的Annexin V-FITC，室温避光条件轻轻地混匀，10 min后，加入5 μl的PI，室温避光条件孵育5 min 后，加入PBS至500 μl，轻轻混匀。在1 h内用流式细胞仪检测。

1.7 Western blot检测 采用预冷的RIPA裂解液提取各组MCF-7细胞的总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白浓度。取30 μg蛋白样品用SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离，电转至PVDF膜后，用Western封闭液室温封闭PVDF膜60 min，Western洗涤液洗膜后，在4℃条件下加入已稀释的相应的Ⅰ抗摇床孵育过夜，Western洗涤液洗膜后，在室温条件下加入相应的已稀释的Ⅱ抗孵育1 h，化学发光显色后拍照，用图像处理软件分析目的条带的灰度值。

2 结果

2.1 LncRNA RMRP和miR-613在乳腺癌细胞中的表达 与正常乳腺细胞HBL-100比较，4种乳腺癌细胞中LncRNA RMRP的表达显著上调，miR-613的表达显著下调(P<0.05)。见表1。

2.2 沉默RMRP对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响 与si-con组和NC组比较，si-RMRP组MCF-7细胞RMRP的表达显著降低(P<0.05)，表明成功构建稳定沉默RMRP的MCF-7细胞株。与si-con组比较，si-RMRP组MCF-7细胞促增殖蛋白CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低，促凋亡蛋白Bax和Cyt-c的表达显著增加，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2，图1。

表1 qRT-PCR检测乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中LncRNA RMRP和miR-613表达量

表2 LncRNA RMRP对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

图1 LncRNA RMRP对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响研究；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检测CyclinD1、Cyt-c、Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.3 过表达miR-613对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响 与miR-con组和NC组比较，miR-613组MCF-7细胞miR-613的表达水平显著升高(P<0.05)，表明成功构建稳定过表达miR-613的MCF-7细胞株。与miR-con组和NC组比较，miR-613组MCF-7细胞促增殖蛋白CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低，促凋亡蛋白Bax和Cyt-c的表达显著增加，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表3，图2。

表3 过表达miR-613对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

图2 Western Blot检测CyclinD1、Cyt-c、Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.4 RMRP靶向miR-613的表达 利用TargetScan进行靶基因预测显示，RMRP与miR-613存在部分连续结合位点，当上调miR-613表达后，转染WT-RMRP的3’-UTR的荧光素酶报告基因载体的MCF-7细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而转染MUT-RMRP的3’-UTR的荧光素酶报告基因载体的MCF-7细胞的荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)。与si-con组比较，si-RMRP组MCF-7细胞miR-613的表达水平显著升高；与pcDNA-con组比较，pcDNA-RMRP组MCF-7细胞miR-613的表达水平显著降低(P<0.05)。见表4、5，图3。

2.5 抑制miR-613表达可部分逆转沉默RMRP对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响 与si-con组比较，si-RMRP组MCF-7细胞RMRP、CyclinD1蛋白及Bcl-2蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，Cyt-c和Bax蛋白的表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与si-RMRP+anti-miR-con组比较，si-RMRP+anti-miR-613组MCF-7细胞RMRP、CyclinD1蛋白及Bcl-2蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)，Cyt-c和Bax蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表6,图4。

表4 miR-con或LncRNA RMRP与报告质粒共转染MCF-7细胞后双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-613的表达

图3 TargetScan对LncRNA RMRP和miR-613结合进行预测示意图

表6 miR-613高表达可以部分逆转LncRNA RMRP高表达对MCF-7的增殖和凋亡的影响

图4 Western Blot检测CyclinD1、Cyt-c、Bax、Bcl-2蛋白表达

3 讨论

研究证实，LncRNA在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用[9,10]。Meng等[11]研究发现RMRP在肺腺癌组织和细胞中的表达明显上调，并且RMRP异常表达增强了肺腺癌细胞增殖、集落形成和侵袭能力；Cao等[12]在膀胱癌的研究中阐明，RMRP在膀胱癌组织中也呈高表达，RMRP的表达与患者的大小、淋巴结转移和生存时间密切相关，RMRP还可通过调控miR-206表达促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，Wang等[13]研究表明，RMRP在非小细胞肺癌中也具有调节功能，沉默RMRP抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导G0/G1期细胞周期阻滞，且RMRP对非小细胞肺癌进展的作用是通过抑制miR-1-3p表达实现的。本研究中我们发现，与正常乳腺细胞相比，4种乳腺细胞中RMRP的表达显著上调，这与Park等[8]的研究结果相吻合。同时我们发现沉默RMRP可抑制MCF-7细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，我们通过生物信息学分析发现miR-613是RMRP的潜在靶基因。

miR-613是一种新发现的在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用的小RNA。Ding等[14]研究发现，miR-613在胃癌组织中表达下调，miR-613的低表达与胃癌淋巴结转移有关，且miR-613通过靶向抑制脑源性神经营养因子表达抑制胃癌的发生发展；研究表明，上调miR-613表达可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，下调miR-613则产生相反的作用。本研究中我们发现，miR-613在乳腺癌细胞中表达下调，过表达miR-613可抑制MCF-7细胞增殖，促进MCF-7细胞凋亡，miR-613在乳腺癌中发挥抑癌基因作用。LncRNA通过调控miRNA表达发挥癌基因或抑癌基因的作用已被广泛报道[15]。Dong等[16]研究发现，HULC通过靶向miR-613可促进结肠癌细胞生长；Cai等[17]发现HOTAIR通过发挥内源性miRNA分子海绵作用抑制miR-613表达促进胰腺癌的发生发展；此外，Jiang等[18]通过体内实验证实敲减HOTAIR通过上调miR-613抑制肿瘤的生长和侵袭，促进细胞凋亡，影响非小细胞肺癌的发生和转移。本研究中，我们通过双荧光素酶报告实验和Western blot检测证实，miR-613是RMRP的靶基因，RMRP可负性调控miR-613的表达。因此，我们猜测RMRP/miR-613分子轴参与对乳腺癌细胞增殖和凋亡的调控，把si-RMRP和anti-miR-613同时转染入MCF-7细胞进行验证，发现抑制miR-613表达可逆转沉默RMRP对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。表明沉默RMRP通过上调miR-613抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，遏制乳腺癌的发生发展。

线粒体作为细胞生命活动的控制中心，在对细胞凋亡的调控中发挥重要作用。其中，Cyt-c从线粒体的释放是线粒体诱导的细胞凋亡的关键步骤，当细胞接收到Bax蛋白调控分子信号后，Cyt-c经线粒体转换孔释放到细胞质，与凋亡相关因子1结合形成多聚体，促进一些列Caspase活化，进而诱导细胞凋亡[19]。Bcl-2则对线粒体诱导的细胞凋亡发挥负性调控作用。本研究中，我们发现沉默RMRP或过表达miR-613均可抑制Bcl-2蛋白表达，促进Bax和Cyt-c蛋白的表达，抑制miR-613表达可逆转沉默RMRP对Bcl-2、Bax和Cyt-c蛋白表达的影响。提示沉默RMRP通过上调miR-613对乳腺癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用与线粒体诱导的细胞凋亡途径的激活有关。

综上所述，RMRP在乳腺癌细胞中表达上调，miR-613表达下调。沉默RMRP通过靶向调控miR-613表达激活线粒体凋亡途径进而促进乳腺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。因此，RMRP/miR-613分子轴有望成为乳腺癌的分子诊疗靶点，本研究的发现为乳腺癌的临床诊疗提供新的思路。