LncRNA NEAT1调控miR-331表达对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响

梁卫勤 林智

鼻咽癌是人体内分泌器官中最为常见的肿瘤类型，发病率逐年递增，具有隐匿性强、进展缓慢的特点，部分患者在初次诊断时已发生转移[1-3]。文献报道，鼻咽癌的发生和癌基因的活化表达相关，因此揭示鼻咽癌相关的基因和调控机制对治疗鼻咽癌具有极其重要的意义[4]。长链非编码RNA(long-chain noncoding RNA，lnc RNA)曾被认为不发挥实际作用，近年来有研究发现，其在肿瘤细胞周期、肿瘤细胞侵袭转移与化疗耐药等相关的信号通路方面均发挥调节作用[5-8]。作为lnc RNA家族成员之一，非编码RNA——NEAT1已被证实在多种疾病的发生发展过程中具有分化调控的作用[9-11]。鼻咽癌的发生发展中有诸多非编码RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的参与，但目前关于NEAT1在鼻咽癌中的作用研究报道甚少，其是否能够调节鼻咽癌细胞的放疗敏感性笔者尚不清楚。因此，本研究通过对鼻咽癌组织和细胞株的研究，探讨NEAT1对鼻咽癌细胞辐射敏感性的分子机制，为新型靶向药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本 48例临床鼻咽癌组织及对应的癌旁组织来自2018年1月至2019年1月于我院接受手术治疗的鼻咽癌患者，男26例，女22例；年龄36～65岁，中位年龄52岁；病程3～15周，平均病程(7.2±1.2)周；根据美国癌症联合会(AJCC)中鼻咽癌病理分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例；患者同意本研究并签署知情同意书，且经医院伦理委员会审核批准。

1.2 实验材料 鼻咽癌细胞株SUNE-1、5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2均购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。siNEAT1及阴性对照siNC稳转干扰细胞系、NEAT1、GAPDH及miR-331引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计完成。DMEM/F12培养基(D8900)，DMEM培养基(D777)，1640培养基(R6504)， L15培养基(L4386)均购自Sigma；SYBR Green 荧光定量PCR 检测试剂盒(QPK-201)于TOYOBO采购；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)采购自碧云天；X射线生物辐照仪购自Thermo；Trizol reagent(9009)采购自TaKaRa；Matrigel基质胶(356234)采购自BD。苏净Airtech超净工作台；SANYO MCO-15AC细胞培养箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜；5810R 型高速离心机；Roche R480实时荧光定量PCR仪。

1.3 细胞转染 调整鼻咽癌细胞株SUNE-1细胞株浓度至1×106个/ml，取2 ml接种于6孔板中，培养过夜，采用Lipofectamine 2000将浓度均为100 nmol/L的siNEAT1和阴性对照转染至细胞，以SUNE-1作为空白对照，得到SUNE-1-siNEAT1及SUNE-1-siNC细胞株。

1.4 qRT-PCR检测Lnc RNA NEAT1和miR-331的表达 采用Trizol法提取各组细胞总RNA并进行反转录，按照PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 个循环；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。U6作为内参(上游引物为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，Lnc RNA NEAT1(上游引物为 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-331(上游引物为 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)相对表达量用2-ΔΔCT表示。每个样本独立重复实验3 次。

1.5 MTT及平板克隆实验检测细胞增殖 细胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1经5 Gy电离辐射照射后，按照每孔500～1 000 个密度铺至96 孔板，轻轻混匀后，置入37℃培养箱继续培养，每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光4 h 后，弃掉孔内液体，再加DMSO各100 μl，置于37℃摇床上快速振荡15 min，以便充分溶解结晶物，最后将96 孔板置于酶标仪上检测 492 nm 处的OD值。将上述两种稳转细胞按每孔5×103个密度铺6孔板继续培养，隔周更换新鲜培养液，2周后用考马斯亮蓝染色，在显微镜下计数菌落形成数量。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭 实验前12 h更换为无血清培养基，细胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1经10 Gy电离辐射照射后，将40 μl matrigel基质胶铺于Transwell小室中，消化细胞并用1×PBS清洗2遍，将500 μl完全培养基加入24 孔板，细胞计数，取5×105细胞重悬，向Transwell小室中加200～250 μl细胞悬液，保证下层完全培养基与Transwell小室间无气泡。置于培养箱内正常培养24 h，加用甲醇配制、PBS 稀释的0.1%结晶紫染液500 μl进行染色，室温避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室内部，倒置晾干，置于倒置荧光显微镜下观察显穿过膜的细胞并拍照计数。

1.7 免疫荧光标记 细胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1经10 Gy电离辐射照射后，分别于0 h、6 h进行免疫荧光检测，将细胞贴附于载玻片上，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定室温下固定 15 min，再经0.1 Triton X-100室温通透细胞20 min，2%羊血清室温封闭1 h，加入γ-H2AX一抗，4℃下孵育过夜，再加入二抗室温孵育1 h，经DAPI核染色后共聚焦显微镜拍照并记录细胞中绿色γ-H2AX foci数量。

1.8 生物信息学预测和荧光素酶报告基因分析 通过检索生物信息学网站starBase预测NEAT1与miRNA-331的靶向结合情况。在此基础上，用 PCR从大鼠星形胶质细胞基因组 DNA中扩增 PI3K的 3’-非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)序列，构建至荧光素酶报告基因载体 pGL3(pGL3-miR-331-WT)中，同时构建突变型重组质粒(pGL3-miR-331-MUT)，将HEK293T 细胞按30%左右密度铺25孔板，将miRNA-331 mimic及mimic control分别与空载质粒及上述质粒共转染至HEK293T 细胞。转染后25 h，根据双荧光素酶测定试剂盒说明书检测荧光素酶活性，萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性值即为报告基因活性。

1.9 Western blotting检测 细胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1经10 Gy电离辐射照射后培养48 h，加入适量的RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4℃离心10min，收集上清，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白样品和Loading buffer混合，100℃水域变性5 min，然后加入至制备好的SDS-PAGE凝胶(5%浓缩胶，10%分离胶)上样孔中，每孔25 μl，浓缩胶时调整电压为60 V，分离胶电压为120 V，结束后取出凝胶，4℃转膜1.5 h，采用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，加入TGF-β、Smad一抗，4℃过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL显影，采用自动凝胶成像系统采集Fig.像，以GAPDH作为内参，分析蛋白水平。

2 结果

2.1 Lnc RNA NEAT1在不同组织及细胞中的表达 RTFQ-qPCR结果显示，鼻咽癌组织中 Lnc RNA NEAT1的表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)； Lnc RNA NEAT1在SUNE-1细胞中表达量最高，与其他细胞株相比差异均有统计学意义(P<0.05)。适合使用RNA干扰的方法进行后续Lnc RNA NEAT1基因功能的研究。见表1、2。

2.2 细胞系构建 qRT-PCR结果显示SUNE-1组和SUNE-1-siNC组Lnc RNA NEAT1的表达无统计学意义(P>0.05)，SUNE-1-siNEAT1组细胞中Lnc RNA NEAT1的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。提示成功构建NEAT1沉默细胞系。见表3。

表1 Lnc RNA NEAT1在不同组织中的表达

表2 Lnc RNA NEAT1在不同鼻咽癌细胞系中的表达

表3 Lnc RNA NEAT1在SUNE-1细胞中的表达

2.3 Lnc RNA NEAT1对鼻咽癌细胞株SUNE-1辐射敏感性的影响 MTT实验结果显示，与SUNE-1组和SUNE-1-siNC组相比，SUNE-1-siNEAT1组经电离辐照后OD492 nm值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。平板克隆实验结果显示，电离辐照后，SUNE-1-siNEAT1细胞克隆数显著减少(P<0.05)。说明Lnc RNA NEAT1被沉默后，能增强鼻咽癌细胞SUNE-1的辐照敏感性。见表4、5，图1。

表4 平板克隆实验Lnc RNA NEAT1对SUN-1辐射敏感性的影响

2.4 Lnc RNA NEAT1对电离辐照诱导的鼻咽癌细胞株SUNE-1侵袭能力的影响 Transwell实验显示，与空白对照组和SUNE-1-siNC组比较，电离辐照后，SUNE-1-siNEAT1细胞通过matrigel基质胶的数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明沉默lnc RNA NEAT1后，抑制鼻咽癌细胞电离辐射后的侵袭能力。见图2，表6。

表5 MTT检测Lnc RNA NEAT1对SUN-1辐射敏感性的影响

图1 平板克隆实验Lnc RNA NEAT1对SUN-1辐射敏感性的影响

图2 Lnc RNA NEAT1对电离辐照诱导的SUNE-1细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色×200)

表6 Lnc RNA NEAT1对电离辐照诱导的SUNE-1细胞侵袭能力的影响

2.5 Lnc RNA NEAT1与miR-331的作用关系 经starbase数据库分析发现NEAT1和miR-331之间有互补结合序列，推测两者可能具有靶向调控关系。双荧光素酶报告基因结果显示，转染miR-331后，野生型NEAT1的荧光素酶活性被抑制(P<0.05)，突变型NEAT1的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，说明NEAT1和miR-331具有靶向调控关系。见表7，图3。

表7 荧光素酶报告基因检测结果

图3 荧光素酶报告基因检测结果

2.6 Lnc RNA NEAT1对鼻咽癌细胞株SUNE-1电离辐射诱导DNA 损伤的影响 免疫荧光结果显示，相比空白对照组SUNE-1和阴性对照组SUNE-1-siNC，SUNE-1-siNEAT1组细胞γ-H2AX的荧光强度更高，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明沉默lnc RNA NEAT1后，抑制鼻咽癌细胞电离辐射后的DNA损伤的修复作用。见表8，图4。

表8 Lnc RNA NEAT1对电离辐射致SUNE-1 DNA损伤的影响

图4 Lnc RNA NEAT1对电离辐射致SUNE-1 DNA损伤的影响

2.7 miR-331在不同细胞中的表达 qRT-PCR检测稳转干扰细胞系和空白细胞对照中miR-331结果表明，lnc RNA ANCR被沉默后，miR-331表达水平显著上调(P<0.05)，证实lnc RNA ANCR可以特异性结合miR-331并发挥负向调控作用。见表9。

表9 miR-331在不同细胞中的表达情况

3 讨论

鼻咽癌因其发病位置比较隐蔽，不容易检查，且早期症状复杂，缺少明显的特征，所以往往被忽视，导致患者治疗时已发生转移。大多数晚期鼻咽癌患者经放射治疗后仍会复发或转移，是治疗失败的主要原因[12,13]，因此研究鼻咽癌的分子机制对于寻找治疗靶点具有重要意义。

Lnc RNA NEAT1包含855个核苷酸，位于人类USP46基因上游的4号染色体上，在其基因组2个内含子中间分别产生一个miR4449和一个SNORNA26，但最终成熟的转录本中却并不包含[14，15]。研究发现，在成骨细胞分化过程中，NEAT1可结合EZH2以增加Runx2 基因启动子区的H3K27me3，进而抑制Runx2的转录[16，17]。有研究表明，Lnc RNA NEAT1是一种与癌症相关的基因，且在多种肿瘤中表达量显著升高[18]。与正常组织相比，Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌组织中的表达明显升高，研究证实Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌细胞中表达量均高于人鼻黏膜上皮细胞，表明Lnc RNA NEAT1的异常表达与鼻咽癌的发生发展密切相关。罗泳林等[19]发现Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中表达水平明显升高，与本研究结果相符。

有研究表明，乳腺癌细胞中沉默Lnc RNA NEAT1可促进 CDK1激酶与 EZH2 结合，使EZH2的苏氨酸Thr-345和Thr-487处磷酸化增加，最终导致EZH2的泛素化降解[20，21]。据报道，在辐射诱导的癌细胞模型中，Lnc RNA NEAT1的表达水平出现异常升高，提示Lnc RNA NEAT1的表达与癌细胞经电离辐射后的应激反应有关[22-24]。本研究结果显示，电离辐射照射后，沉默Lnc RNA NEAT1的鼻咽癌细胞株SUNE-1增殖和迁移能力明显受到抑制，提示沉默Lnc RNA NEAT1能够增强鼻咽癌辐射敏感性。电离辐射可引起肿瘤细胞DNA双链断裂，不能修复的DNA损伤会介导细胞凋亡而被清除，γH2AX作为DNA双链断裂的标志物，可有效反映DNA损伤程度[25，26]。本研究结果中，沉默Lnc RNA NEAT1后肿瘤细胞γH2AX表达明显高于对照组，提示抑制Lnc RNA NEAT1的表达可加剧DNA损伤或降低DNA损伤的修复能力。以上结果表明，lnc RNA NEAT1在鼻咽癌的发生发展过程中发挥重要调节作用，有望作为该病的治疗及预后的标志因子。

微小RNA(MicroRNA，miRNA) 是存在于真核生物中一类长度为18～25 nt的非编码单链小分子RNA，其作用机制主要是直接结合在特定的靶信使RNA的3’非转录区，促使靶RNA发生降解或者翻译被抑制，从而调控目的基因的表达。越来越多研究发现，种类繁多的miRNA家族成员与人类多种疾病及肿瘤的发展密切相关[27，28]。miR-331基因位于人类染色体的12q22n上，相关研究证实，miR-331对前列腺癌、胃癌、结直肠癌及宫颈癌均发挥抑制作用，但在肝癌中促进细胞增殖及转移进而起到促癌作用，在淋巴细胞白血病中，miR-331表达异常且参与细胞增殖及迁移[29]。lnc RNA NEAT1调控鼻咽癌的发生发展过程中是否有miR-331参与鲜有报道。lnc RNA对不同细胞具有多向调节功能，因而在诸多人类疾病中发挥重要作用，有研究证实了mRNA和lnc RNA之间一种新的调控机制，即两者的相互影响跟它们竞争共同的miRNA反应元件有关，此时lnc RNA可能发挥了竞争性内源性RNA的作用，对miRNA进行吸附并调控其靶标，从而使转录后调控水平进一步增加[30，31]。本研究同时采用starbase数据库对lnc RNA NEAT1的靶基因进行预测，分析发现lnc RNA NEAT1和 miR-331之间存在一定的结合位点，由此推测miR-331可作为lnc RNA NEAT1的下游靶基因。此外采用荧光素酶报告基因实验检测miR-331与全lnc RNA NEAT1转录本的结合能力，发现两者能形成一定的互补碱基对，进一步证实了两者的靶向关系。RTFQ-qPCR检测发现，鼻咽癌细胞中沉默lnc RNA NEAT1后，miR-331表达水平显著上调，证实lnc RNA NEAT1对miR-331发挥负向调控作用。以上结果表明，在鼻咽癌中lnc RNA NEAT1可能通过特异性结合并抑制miR-331的表达进而发挥抑癌作用。

综上所述，lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中呈高表达，沉默Lnc RNA NEAT1表达可能通过上调miR-331水平抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力，增加鼻咽癌细胞辐射敏感性。