上海市门诊宠物猫和动物园流浪猫的猫疱疹病毒1型中和抗体检测

2020-10-10

中国动物检疫 2020年10期

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猫疱疹病毒1型（feline herpesvirus type 1，FHV-1）能引起猫急性上呼吸道感染，是猫传染性鼻气管炎的病原[1]。从临床表现看，这种疱疹病毒所引起的疾病，与猫鼻结膜炎（杯状病毒引起）、猫传染性泛白细胞减少症（细小病毒引起）和猫肺炎（衣原体引起）很难区分，只有靠特异的血清学反应、病原分子生物学检测或病原分离鉴定才能做出准确诊断[2]。猫传染性鼻气管炎是一种高度接触性传染病，发病率很高，可达100%。虽然成年猫感染FHV-1后大多痊愈，病死率很低，但幼仔猫感染后症状严重，病死率可达50%，甚至终生带毒排毒，并可垂直传播，危害很大[3]。近年来，广东、江苏和上海等地华南虎和东北虎相继发生以流鼻涕、咳嗽、支气管充血出血为主要症状的传染性疾病，经病毒分离和基因测序鉴定为虎源性FHV-1感染[4]。

本研究采集已免疫三联疫苗（猫瘟病毒、FHV-1和猫杯状病毒）的家养猫血清20份和未免疫的动物园流浪猫血清10份，采用中和试验方法检测FHV-1抗体滴度，从而了解疫苗的免疫效果和未免疫流浪猫的感染状况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细胞和阳性血清 FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株，由本实验室2014年分离鉴定；F81细胞，由本实验室保存；FHV-1标准阳性血清，由FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株灭活后免疫猫制备获得，中和效价为1:512。

1.1.2 试剂 DMEM细胞培养液（批号2126865），胰酶消化液（0.25%，批号2042303），均购自GIBCO公司；胎牛血清（FBS，批号2418），购自SIGMA公司。

1.1.3 耗材 25 m2细胞培养瓶、24孔细胞板、吸管、10 mL一次性移液管、5 mL采血器。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 2020年3月，集中采集家养猫（已免三联苗1个月至2年）血清20份，采集非免疫动物园流浪猫血清10份。于猫前臂头静脉采血4 mL，37 ℃放置1 h，凝固后1 000 r/min离心10 min，取上清血清备用。

1.2.2 病毒增殖将贴壁生长的F81细胞消化成细胞悬液，然后稀释为1×106个/mL；采用同步培养方式，将1 mL FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株病毒原液加入到10 mL细胞悬液中，轻微摇动混匀后于37 ℃、5% CO2浓度培养箱中培养，每12 h观察细胞病变；当70%细胞出现细胞病变（CPE）、圆缩和脱落时，将培养液冻融3次，2 000 r/min离心5 min，收获病毒上清，分装备用。

1.2.3 TCID50测定将收获的FHV-1病毒液进行10倍倍比稀释，共稀释12个梯度；将消化好的F81细胞稀释为1×106个/mL，然后加入到24孔板中，每孔500 μL；同时将稀释好的病毒液也加入到24孔板中，每孔100 μL，每个稀释度重复8个孔；轻微摇动混匀后于37 ℃、5% CO2浓度培养箱中培养，4 d后显微镜下观察结果。出现CPE的孔记为+，未出现的记为-。按照Reed-Muench法，计算该病毒悬液的TCID50[5]。

1.2.4 病毒中和试验根据测定的TCID50值，将FHV-1悬液稀释成100个TCID50/100 μL；将标准阳性血清、阴性血清以及待测血清样品56 ℃灭活30 min，然后用细胞培养基2倍倍比稀释至1:212；吸取各稀释度血清500 μL加入到1.5 mL离心管中，同时加入500 μL已稀释好的FHV-1病毒液，轻轻摇晃混合后于37 ℃孵育1 h；将消化好的F81细胞稀释为1×106个/mL，然后加入到24孔板中，每孔500 μL；同时将血清病毒混合液也加入到24孔板中，每孔100 μL，每个稀释度重复4个孔，同时设置血清、病毒和正常细胞对照；于37 ℃、5%CO2浓度培养箱中培养5 d，显微镜下观察细胞病变。一半以上细胞出现CPE的孔视为阳性，该血清稀释倍数即为血清效价[6]。待检血清的中和指数大于50，即可判为阳性，10～49为可疑，小于10为阴性[7]。

2 结果

2.1 病毒增殖

FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株病毒液同步接种到F81细胞中，2 h时30%的细胞完成了贴壁生长，6 h时70%完成了贴壁生长；12 h时细胞出现轻微病变，细胞边缘变得模糊；24 h时细胞出现典型CPE，细胞圆缩、聚集；36 h时细胞基本脱落，呈现折光率增强、成团块等现象（图1）。

2.2 TCID50测定

对本试验培养的FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株病毒液进行TCID50测定，每个病毒稀释度出现CPE的孔数见表1。按照Reed-Muench法，计算出该病毒悬液的TCID50为10-5.33/0.1 mL。

图1 FHV-1接种F81细胞后的病变观察结果

表1 FHV-1 TCID50的测定结果

2.3 中和抗体检测

20份家养猫血清中，检出阳性12份，检出率为60%（12/20）；10份流浪猫血清中，检出阳性6份，检出率为60%（6/10），详见图2和表2。

3 讨论

图2 部分血清中和病毒后接种F81细胞观察结果

表2 FHV-1血清中和抗体检测结果

猫传染性鼻气管炎是目前已知的重要猫呼吸道疾病之一，可导致幼猫出现较高的发病率和死亡率，严重危害猫的健康[8]。虽然有很多关于FHV-1新型疫苗的报道，市场上也有商品化疫苗，主要为“猫三联”和“猫四联”，但其免疫效果不稳定，免疫期内仍有该病反复发生[9]。张晓明等[10]原核表达了FHV-1 gD蛋白基因，建立了ELISA检测方法，为FHV-1抗体快速检测奠定了基础。虽然ELISA具有快速、便捷，对人员技术要求不高等特点，但其特异性和敏感性与中和抗体法有较大差距。

本研究利用临床分离病毒建立了FHV-1中和抗体检测方法，这是中和抗体检测的经典方法。检测结果显示，临床宠物猫的FHV-1免疫中和抗体合格率只有60%，虽然部分猫的抗体效价达到1:210，但也存在15%的猫抗体为0，25%的猫免疫抗体不合格，抗体滴度达不到抵抗病毒感染的效价。因此，建议宠物猫免疫FHV-1疫苗后需进行中和抗体效价测定，中和抗体效价不合格的需要补免，以确保免疫抗体滴度达到要求。

本研究对动物园流浪猫血清进行了FHV-1中和抗体检测，发现抗体阳性率为60%，感染率高达80%，表明该动物园流浪猫感染FHV-1较普遍。建议对动物园流浪猫进行定期捕捉、免疫和收容，加强动物园猫科动物的FHV-1免疫和监测。

FHV-1不仅感染猫，对猫科的其他动物如虎、豹等，也有较高的致病性。2012年，广东省某地的2只成年东北虎出现精神沉郁、食欲下降、结膜发炎，眼鼻出现浆液性分泌物，经抗生素治疗无效，5 d后死亡；毗邻的华南虎也出现结膜发炎和眼鼻出现浆液性分泌物等症状，采取阿昔洛韦等抗病毒药物治疗7 d后康复[4]。从病料中分离到病毒粒子，经基因序列分析鉴定为虎源性FHV-1，但注射FHV-1灭活疫苗或弱毒疫苗对虎的免疫保护效果较差[11]。建议研发适用于大型猫科动物使用的FHV-1疫苗[12]，同时应当加强动物园流浪猫和猫科动物的FHV-1病原学检测[13-15]。