吉林和黑龙江两省猪鸡源产ESBLs大肠杆菌耐药检测与优势基因型分析

王 琳，刘 娜，高玉斌，刘俊辉，张喜悦，王君玮，曲志娜（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

β-内酰胺类抗生素是兽医临床抗感染常用药。由于在畜禽养殖业中被广泛应用，β-内酰胺类抗生素耐药菌株不断出现并广泛流行，多重耐药现象严重[1]。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）由质粒编码，能通过接合、转化和传导等形式，使耐药基因在细菌间扩散，可水解青霉素类、头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗生素[2]，从而导致细菌对该类药物耐药。目前已发现的ESBLs型已经超过400种，且不同国家或地区流行的基因型和基因亚型存在差异[3]，主要为CTX-M型、TEM型、SHV型和OXA型等[4-5]。近年来的研究报道也显示，在我国，CTX-M型产ESBLs菌株逐渐占主导地位[6]。本研究以2018年吉林和黑龙江两省猪鸡源大肠杆菌为研究对象，通过产ESBLs菌株的检测、耐药性分析及其耐药基因研究，获得产ESBLs菌株的耐药特征与优势基因型，以期为控制ESBLs菌株的快速传播提供依据。

1 材料

1.1 试验菌株

210株大肠杆菌来自吉林省（猪源50株、鸡源51株）和黑龙江省（猪源57株、鸡源52株），于2018年4—7月从12个猪场和17个鸡场的肛门/泄殖腔拭子中分离获得；质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大肠杆菌ATCC 25922，均由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室保存、提供。

1.2 主要试剂与仪器

胰蛋白胨大豆肉汤、MH（Mueller-Hinton）肉汤、氯化钠、GoTaq Green Master Mix酶、DL 1 000 DNA Marker、琼脂糖，购自TaKaRa公司。

药敏纸片包括，头孢噻肟（CTX，30 μg/片），头孢他啶（CAZ，30 μg/片），氨曲南（AZT，30 μg/片），头孢曲松（CRO，30 μg/片），头孢他啶/克拉维酸（CAZ/Clav，30/10 μg/片），头孢噻肟/克拉维酸（CTX/Clav，30/10 μg/片），均购自北京天坛药业生物技术开发公司。

96孔药敏检测板，含有青霉素类（氨苄西林）、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物类（阿莫西林/克拉维酸）、头孢菌素类（头孢噻呋、头孢他啶）、氨基糖苷类（庆大霉素、大观霉素）、四环素类（四环素）、氯霉素类（氟苯尼考）、磺胺类（磺胺异噁唑、复方新诺明）、氟喹诺酮类（恩诺沙星、氧氟沙星）、多肽类（黏菌素）、碳青霉烯类（美罗培南）等14种药物，均购自上海星佰生物技术有限公司。

其他仪器包括：生物安全柜（HFsafe-1800），购自上海力申科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（DK-98-I），购自天津市泰斯特仪器有限公司；可见分光光度计（722N），购自上海精密科学仪器有限公司；基因扩增仪（MLX-210），购自杭州博日科技有限公司；电泳仪（FR-180C），购自上海复日科技有限公司；凝胶成像分析仪（Tanon 2500BR），购自上海天能科技有限公司；小型冷冻离心机（CT 15RE，日立），旋转培养箱（1011A-2，日本），快速涡匀器（HYQ-2121A，SilentShake），比浊仪（OXOID）。

2 方法

2.1 ESBLs表型检测

试验具体操作步骤和判读结果，按照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准进行，分为筛选试验和确证试验两部分[7]。以肺炎克雷伯菌ATCC 700603作阳性对照，以大肠杆菌ATCC 25922作阴性对照。

2.2 药敏试验

根据 CLSI标准，采用微量肉汤稀释法测定210株大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC），以大肠杆菌ATCC 25922作为标准质控。试验菌的结果用敏感（S）、中敏（I）和耐药（R）报告，对3类及以上抗菌药物同时耐药的菌株记为多重耐药菌。

2.3 ESBLs基因型检测

利用PCR方法检测ESBLs常见基因型。引物[8-9]由擎科生物公司合成（表1）。将PCR扩增阳性产物送至擎科生物公司进行测序，并与NCBI进行序列比对，来确定目的基因型。

2.4 数据处理与分析

利用SPSS软件进行差异显著性分析。P＜0.01，差异极显著；P＜0.05，差异显著；P＞0.05，差异不显著。

3 结果与分析

3.1 ESBLs表型检测

210株大肠杆菌中，共检出73株产ESBLs菌株，检出率为34.76%（73/210）。73株产ESBLs菌株中：黑龙江省40株，检出率为36.70%（40/109），吉林省33株，检出率为32.67%（33/101），差异不显著（P=0.54）；猪源17株（15.89%，17/107），鸡源56株（54.37%，56/103），差异极显著（P＜0.01）；两省间的猪源（P=0.276）和鸡源（P=0.061）产ESBLs菌株检出率差异均不显著。

表1 引物序列及目的片段大小

3.2 药敏试验

3.2.1 总体耐药性 210株大肠杆菌对四环素（90.95%）和磺胺异噁唑（80.0%）最耐药，其次对氨苄西林、复方新诺明和氟苯尼考，耐药率均在60%以上，对头孢他啶（7.62%）耐药率最低。具体结果见表2。

3.2.1.1 不同动物来源对比 结果（表2）显示：鸡源大肠杆菌对13种药物的耐药率均比猪源高，其中对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、头孢噻呋、头孢他啶、氟苯尼考、恩诺沙星、氧氟沙星和黏菌素等9种药物耐药差异极显著（P＜0.01），对大观霉素、磺胺异噁唑和复方新诺明3种药物耐药差异显著（P＜0.05）。

3.2.1.2 不同地区对比 结果（表2）显示：吉林省分离菌株对10种药物的耐药率高于黑龙江省，但仅对阿莫西林/克拉维酸、磺胺异噁唑和大观霉素3种药物的耐药率显著高于黑龙江省菌株（P＜0.05），而其他药物两省差异不显著（P＞0.05）。

表2 210株大肠杆菌耐药检测结果及差异性分析

3.2.2 产ESBLs和非产ESBLs菌株耐药比较产ESBLs菌株对13种药物的耐药率均高于非产ESBLs菌株，其中对阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、磺胺异噁唑、头孢噻呋、头孢他啶、氟苯尼考、恩诺沙星和氧氟沙星等8种药物的耐药差异极显著（P＜0.01），对复方新诺明和黏菌素耐药差异显著（P＜0.05）。具体结果见表3。

3.2.2.1 不同动物来源对比 鸡源产ESBLs菌株对庆大霉素和头孢噻呋的耐药率极显著高于猪源（P＜0.01），对头孢他啶和氟苯尼考的耐药率显著高于猪源（P＜0.05）。

3.2.2.2 不同地区对比 吉林和黑龙江两省间，产ESBLs菌株除对阿莫西林/克拉维酸、黏菌素、四环素和复方新诺明耐药率差异显著（P＜0.05）外，对其他药物差异均不显著（P＞0.05）。

3.2.3 不同来源多重耐药比较 210株大肠杆菌分离菌株多重耐药率为83.33%（175/210），其中猪源菌株多重耐药率为77.57%（83/107），鸡源菌株为89.32%（92/103），差异显著（P=0.022）。鸡源耐药菌株主要集中在6～8耐，占70.87%；猪源耐药菌株主要集中在3～5耐，占57.01%。经卡方检验，两种来源的6～8耐菌株占比差异极显著（P＜0.01）。具体结果见表4。

3.2.4 产ESBLs和非产ESBLs菌株多重耐药比较 产ESBLs菌株多重耐药率为98.63%（72/73），非产ESBLs菌株多重耐药率为75.18%（103/137），差异极显著（P＜0.01）。产ESBLs菌株中，7耐、8耐最多，占58.90%；非产ESBLs菌株中，3耐、4耐最多，占38.69%。

3.2.4.1 不同来源对比 鸡源产ESBLs菌株多重耐药率为100%（56/56），高于猪源产ESBLs菌株的94.12%（16/17），但差异不显著（P=0.068）。

3.2.4.2 不同地区对比 吉林省产ESBLs菌株多重耐药率为100%（33/33），黑龙江省为97.50%（39/40），差异不显著（P=0.360）。吉林省8耐菌株数最多，占36.36%（12/33），黑龙江省7耐菌株数最多，占45.0%（18/40）。两省6～8耐菌株数差异不显著（P=0.499），具体结果见表5。

表5 不同地区产ESBLs菌株多重耐药检测结果

3.2.5 ESBLs基因型检测 73株产ESBLs菌株主要基因型为CTX-M型（97.26%，71/73），其次为TEM型（50.68%，37/73），OXA型仅在鸡源中检出（16.44%，12/73），两种来源菌株均未检出SHV型。经卡方检验，鸡源CTX-M型和OXA型检出率（100%、21.43%）明显高于猪源（88.24%、0），差异显著（P＜0.01），而猪鸡源TEM型检出率差异不显著（P=0.73）。两省之间对于各基因型的检出率均差异不显著（P＜0.05）。具体结果见表6。

4 讨论

4.1 猪鸡源大肠杆菌耐药情况

本研究结果显示，210株大肠杆菌对四环素、磺胺异噁唑、氨苄西林、复方新诺明和氟苯尼考的耐药率均在60%以上，且多重耐药问题严重，多重耐药率为83.88%。温肖会等[10]对广东省229株大肠杆菌进行试验发现，229株大肠杆菌对四环素、复方磺胺甲噁唑、阿莫西林和氨苄西林的耐药率均在75%以上，且存在多重耐药性，其中6株大肠杆菌可耐26种药物；曾莉[5]对不同来源的大肠杆菌进行研究发现，试验菌株对氨苄西林、复方新诺明和四环素耐药率在70%以上；王志浩等[11]研究发现，山东省336株大肠杆菌对四环素、氨苄西林和多西环素的耐药率均达到78%以上；李鹏[12]研究发现，西藏地区大肠杆菌对四环素最耐药，多重耐药率为24.8%。以上研究说明，大肠杆菌对多种兽用抗菌药物普遍产生耐药性。另外本研究还发现，吉林和黑龙江两省鸡源大肠杆菌比猪源耐药严重，对12种药物的耐药率均显著高于猪源，其中吉林省菌株对10种药物的耐药率均高于黑龙江省。由于样品来源和监测地点等不同，大肠杆菌会呈现不同耐药特征，因此在实际生产中应因地制宜，加强抗菌药使用的监督管理，尤其鸡源生产中要规范药物使用种类及用量，降低耐药细菌的产生和传播，以及由此导致的对人类健康的影响。

4.2 产ESBLs菌株流行及耐药情况

ESBLs自报道以来在世界各地均有发现，我国各地也有检出。马馨等[13]报道，山西省鸡源大肠杆菌产ESBLs菌株检出率为68.33%；郑新添等[14]报道，福建省龙岩市猪源大肠杆菌产ESBLs菌株检出率为28.6%；曹敏等[15]报道，贵州省猪源大肠杆菌产ESBLs菌株检出率为83.54%；坤清芳等[16]从四川省各地区的家兔养殖场中采集分离的97株大肠杆菌进行ESBLs表型检测，结果有69株被确证为产ESBLs菌株，检出率为71.13%。本试验结果显示，黑龙江省、吉林省产ESBLs菌株检出率分别为36.70%、32.67%，差异不显著，但猪源产ESBLs菌株检出率（15.89%）显著低于鸡源（54.37%），说明产ESBLs大肠杆菌在不同地区、不同动物之间均有流行且存在差异。

表6 产ESBLs菌株基因型检测结果与差异显著分析

产ESBLs菌株比非产ESBLs菌株耐药严重，且对不同作用机制的抗菌药表现出更高水平的多重耐药。薛原等[17]对黑龙江省哈尔滨市30株大肠杆菌进行检测，发现产ESBLs菌株的耐药率均比非产ESBLs菌株高；裴亚玲[18]对河南省鸡源大肠杆菌进行检测发现，35株鸡源大肠杆菌中有22株为产ESBLs菌株，且产ESBLs菌株对15种抗菌药的耐药率高于非产ESBLs菌株；坤清芳等[16]对四川省97株兔源大肠杆菌进行试验，发现产ESBLs菌株多重耐药率（100%）高于非产ESBLs菌株（85.71%），差异极显著（P＜0.01）。本试验中，产ESBLs菌株对13种药物的耐药率均高于非产ESBLs菌株，且鸡源产ESBLs菌株对庆大霉素、头孢噻呋的耐药率极显著高于猪源，产ESBLs菌株的多重耐药率极显著高于非产ESBLs菌株（75.18%），鸡源产ESBLs菌株多重耐药率高于猪源，从而进一步证实了产ESBLs多重耐药菌株已在不同地区、不同来源的养殖场中广泛流行。

4.3 ESBLs基因型与基因亚型分布情况

虽然产ESBLs菌株近年来在世界各地流行，但不同国家和地区之间流行的基因型仍存在明显差异[19]。Fortini等[20]对分离自尼日利亚伊巴丹健康鸡和猪的162株大肠杆菌进行试验，发现所有菌株均携带TEM型基因；沈莉萍等[21]研究发现，上海市猪源产ESBLs菌株主要以CTX-M型居多，未检出SHV和OXA型；Li等[22]研究发现，禽和猪养殖场产ESBLs菌株主要为CTX-M型。OXA型ESBLs主要存在于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中[23]，而在大肠杆菌中比较少见。SHV型在不同地区、不同动物源性大肠杆菌中检出都较少。本试验结果显示，产ESBLs菌株主要基因型为CTX-M型（97.26%），其次为TEM型（50.68%），OXA型仅在鸡源中检出，但在两种动物来源的菌株中均未检出SHV型，所以在养殖场日常管理中要防范耐药基因的流行与传播，加强规范用药。