PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

黄小武，杜 倩，闭璟珊，韦正吉，邹联斌，赵子欣，闫修魁，韩知晓，辛佳亮，郑 敏

（1.柳州市动物疫病预防控制中心，广西柳州 537000；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530001；3.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）、圆环病毒属（Circovirus），是目前发现最小的病毒之一[1]。PCV为无囊膜单股正链环状DNA病毒，病毒基因组全长约1.7～2.0 kb，包含两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码复制酶蛋白（replicase protein，Rep）[2]和衣壳蛋白（capsid protein，Cap）[3]。其中Cap蛋白包含多个中和抗体表位[4]。2019年之前，仅发现了PCV的3个成员。其中，PCV1对猪没有致病性；PCV2和PCV3被认为是猪圆环病毒病的主要病原体，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和猪皮炎与肾病综合征（porcine dermatitis nephropathy syndrome，PDNS）等临床疾病，给养猪业带来了巨大的经济损失[5]。

2019年，我国在湖南省患有呼吸道、消化道疾病和PDNS的猪群中首次检测到了另一种新型猪圆环病毒——PCV4，其与PCV1～3型具有明显的遗传差异[6]。为进一步了解PCV4在国内外的流行情况，迫切需要一种快速、简便、灵敏度高及特异性好的检测方法，为此，本研究拟建立一种针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，以期为PCV4相关疫病的早期诊断和分子流行病学调查提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

PCV1（GXdx115、KX827778），PCV2（疫苗株SX07株），PCV3（Shandong-01、MH107161），猪流行性腹泻病毒（PEDV，疫苗株CV777株）和猪繁殖与障碍呼吸综合征病毒（PRRSV，疫苗株TJM-F92株）等，均由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心保存；56份猪临床样本，采集于广西南宁、桂林及河池等地猪场；FastPure® Plasmid Mini Kit质粒小提试剂盒、FastPure® Blood/Cell/Tissue/Bacteria DNA Isolation Mini Kit及DL 15 000 DNA Marker，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；SYBR Green I PCR Master Mix，购自美国Promega公司。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI上已发表的PCV4基因序列（GenBank登录号MK986820.1），选取Rep基因保守区域，利用Primer 5.0设计合成一对特异性引物，PCV4-QF：5'-AAACAGCATATTGACGCTGG-3'；PCV4-QR：5'-CGTTCTGTGCCTGGAATGAT-3'，扩增片段长度为146 bp。引物由华大基因科技有限公司合成。

1.3 标准品质粒制备

选择PCV4Rep基因保守区域送华大基因合成，克隆至pUC57载体并命名为pUC57-PCV4。将含有pUC57-PCV4的菌液接种于6 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养11 h，按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒后于4 ℃保存备用。

1.4 反应条件优化

以pUC57-PCV4质粒为模板，利用方阵法对模板用量、引物浓度、退火延伸温度及时间等条件进行优化，确定最适反应条件。

1.5 标准曲线建立

利用分光光度计测定标准品质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数，拷贝数＝[6.02×1014×浓度（ng/μL）]/（片段大小×660），获得阳性质粒的拷贝数为5.64×1010copies/μL。对标准质粒进行10倍梯度稀释，以梯度稀释后的质粒作为标准品。用优化后的反应条件进行荧光定量PCR扩增，建立标准曲线和熔解曲线。

1.6 敏感性检测

利用ddH2O对重组质粒pUC57-PCV4进行10倍梯度稀释，分别进行普通PCR与qPCR扩增，比较两种方法检测的最低拷贝数，同时设置阴性对照。

1.7 特异性检测

提取PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV及PEDV阳性样品的基因组作为检测模板，以重组质粒pUC57-PCV4为阳性对照，ddH2O为阴性对照。以1.4中优化好的反应体系和条件进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，进行特异性试验并分析。

1.8 重复性检测

选取其中3个稀释梯度（5.64×104～5.64×106copies/μL）的标准品质粒作为模板，分别进行3次组内与组间平行试验，比较组内和组间的Ct值及变异系数。验证荧光定量PCR方法的重复性。

1.9 临床样品的检测

将采集的56份猪临床样品根据试剂盒说明书提取基因组DNA，利用本研究中建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 反应条件优化

通过方阵法对SYBR Green I实时荧光定量PCR反应体系和条件进行筛选和优化，确定最佳反应体系：2×SYBR Green I Master Mix 10 μL，上下游引物各0.3 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8.4 μL。反应条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，40个循环。

2.2 标准曲线建立

根据质粒浓度计算出标准质粒的拷贝数浓度为5.64×1010copies/μL，将标准质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增。结果显示，Ct值与标准品质粒拷贝数呈良好的线性关系（图1），线性回归方程为y=-3.638x+44.446，R2=0.999。

图1 标准曲线

2.3 熔解曲线

对不同拷贝数浓度的标准品质粒进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，结果（图2）显示，在82.3 ℃左右可见狭窄、单一的特异性熔解峰，熔解峰高度与标准质粒的浓度呈正相关。

图2 熔解曲线

2.4 敏感性

用5.64×109～5.64×102copies/μL的标准质粒分别进行普通PCR和实时荧光定量PCR扩增，结果如图3和图4显示，实时荧光定量PCR的检测下限为5.64×102copies/μL，而普通PCR的检测下限为5.64×105copies/μL，实时荧光定量PCR方法检测PCV4的敏感性是普通PCR方法的1 000倍。

图3 SYBR Green I 实时荧光定量PCR敏感性分析结果

图4 普通PCR敏感性分析结果

2.5 特异性试验

利用本研究建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，以PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV及PEDV基因组DNA为模板，验证方法的特异性。结果（图5）显示，仅PCV4出现特异性扩增，而PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、PEDV及阴性对照均未出现特异性扩增。

图5 特异性分析结果

2.6 重复性试验

以3个不同稀释倍数（5.64×104～5.64×106copies/μL）的标准品质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增，分别进行3次组内和组间的重复性试验。结果（表1）显示，组内变异系数在0.08%～0.38%之间，组间变异系数在0.04%～0.08%之间，均小于2%，表明该方法具有较好的重复性，荧光定量PCR扩增效率稳定。

表1 SYBR Green I实时荧光定量PCR检测重复性试验结果

2.7 样品检测

利用本研究中建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，对56份猪临床样品进行检测，结果有2份样品检测为阳性，阳性率为3.57%（2/56）。其中，Ct值分别为30.148和19.935，拷贝数分别为8.5×103copies/μL和5.4×106copies/μL。将2份阳性样品扩增产物回收后送公司测序，发现与PCV4参考毒株HNU-AHG1-2019同源性为100%。使用普通PCR方法检测上述56份猪临床样品，仅检测到1份样本为阳性，阳性率为1.79%（1/56），且与荧光定量PCR检测结果一致。

3 讨论

PCV是猪圆环病毒病的元凶。多项研究证实PCV主要诱导淋巴细胞的凋亡导致免疫抑制和耗竭，进而促进其他病原体的感染与增殖[7-9]。临床上PCV主要引起PMWS和PDNS。此外，PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联[10]。近年来，PCV在全球多个国家暴发流行，而且流行范围正不断扩大[11]。流行病学调查显示，我国多个省份猪场均检测到PCV2和PCV3，且部分地区阳性率高达80%以上，说明PCV已经在我国广泛传播[12]。此外，PCV2和PCV3均被证实能跨物种传播[13-14]。2019，从我国湖南省有严重临床症状的病猪样本中检测到一种新型PCV—PCV4。通过基因组比对分析，该病毒与PCV1、PCV2和PCV3的全基因组同源性仅为43.2%～51.5%，ORF2的核酸序列同源性仅为24.5%～45%，表明PCV4是一种与PCV1、PCV2和PCV3完全不同的新型PCV。随后河南省和陕西省的猪场均检测到该病毒[15]。流行病学调查表明PCV4可能与PCV2和PCV3相似，引起PMWS和PDNS。

PCV4作为一种新发现的病毒，尚没有成熟稳定有效的检测方法，急需一种敏感性好、特异性高的检测方法。实时荧光定量PCR由于操作简单、适合大量样本检测，已经逐渐在病原微生物检测、临床样品检测和基因研究等方面得到广泛应用。SYBR Green I作为常用的荧光染料，对双链DNA具有高度专一性，且对引物设计要求一般，成本低且操作简便。SYBR Green I实时荧光定量PCR方法已经在PCV2和PCV3检测中得到广泛应用和验证。本试验根据NCBI上已公布的PCV4的Rep基因保守区域设计了1对特异性引物，通过对PCR反应体系和条件进行筛选和优化，以标准品质粒为模板建立一种针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的标准品与Ct值在5.64×102～5.64×109copies/μL范围内呈良好的线性关系，R2为0.999，检测下限为5.64×102copies/μL。郭慧娟等[16]建立的针对PCV2的荧光定量PCR方法检测下限为6.84×102copies/μL，李卓昕[17]建立的针对PCV3的荧光定量检测方法检测下限为4.24×101copies/μL。以上结果表明本研究建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法灵敏度能够满足临床检测需要。利用该方法检测PCV1、PCV2和PCV3均未出现特异性扩增，特异性熔解峰均在82.3 ℃，组间和组内的变异系数均小于2%，表明本研究建立的方法重复性好。利用本研究建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法对56份临床样本进行检测，阳性率为3.57%（2/56），检测结果与测序结果相符，而普通PCR检出率仅为1.78%，说明本研究建立的荧光定量方法更加灵敏可靠，更加适用于临床检测。

综上所述，本研究建立了一个快速、灵敏、特异的PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，能初步满足其临床快速诊断需要。