血清型特异性水泡性口炎病毒同步检测和鉴别方法的建立

（中国海关科学技术研究中心，北京 100026）

水泡性口炎（vesicular stomatitis，VS）是由水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）引起的多种哺乳动物和人感染的一种人兽共患传染病，其中马、牛、猪和某些野生动物较易感，绵羊和山羊也可感染，但不发生自然感染，临床上以口、鼻等黏膜和皮肤水泡及糜烂为特征。该病可以跨界、跨物种传播，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病，在我国为外来动物疫病，是我国动物和动物产品国际贸易中的重要检疫对象[1-5]。VSV有2个血清型，代表株分别为新泽西株（VSV-NJ）和印第安纳株（VSV-IND）。易感动物对不同血清型感受性不同，马、牛、猪是VSV-NJ型病毒的主要自然宿主，而VSV-IND曾引起牛和马的水泡性口炎流行，但不引起猪的疾病。这两个血清型在血清学和免疫学上独立，但临床症状难以区分[4-8]。本研究建立了可以同步检测和鉴别VSV-NJ和VSVIND的双重荧光RT-PCR方法，以期为VS的防控提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 试验质控品

VSV-NJ和VSV-IND阳性质控品，均为本实验室制备的L基因体外转录cRNA（VSV-NJ-LcRNA和VSV-IND-L-cRNA）；测试所用的其他病毒，均为本实验室制备的核酸质控品，上述核酸质控品均按常规方法制备[9-10]。

1.2 主要试剂及仪器

pGEM-T载 体、Riboprobe RNA Production System-T7体外转录试剂，为Promega公司产品；Ex-TaqPCR试剂，为TaKaRa公司产品；Path-IDTMMultiplex one-step RT-PCR kit，为AB公司产品；TIANamp Virus DNA/RNA Kit，为天根公司产品；CFX-96荧光PCR仪，为Bio-Rad公司产品。

1.3 引物和探针设计与合成

下载GenBank中现有VSV-NJ和VSV-IND所有分离株基因，使用CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1分析软件进行多重比较，选取L基因作为扩增靶基因，根据双重荧光RT-PCR特点分别设计并筛选出能覆盖大部分分离株、又适合双重检测，并可以区分不同血清型的引物和探针（序列见表1）。引物和探针由TaKaRa（大连宝生物）合成，用灭菌水稀释成100 mmol/L储藏液，-20 ℃保存备用。

1.4 阳性质控品浓度测定

VSV-NJ-L-cRNA和VSV-IND-L-cRNA阳性质控品经测序确认后测定其OD260和OD280值，按照公式[6.02×1023×浓度（ng/μL）×10-9]/[片段长度（bp）×660]计算拷贝数，并于-20 ℃保存备用。

1.5 双重荧光RT-PCR反应

将引物和探针储备液按照引物终浓度400 nmol/L和探针终浓度200 nmol/L分别进行10倍稀释和混合，引物混合液包括VSV-NJ引物3条和VSV-IND引物2条，探针混合液包括VSVNJ、VSV-IND探针各1条（表1）。按照表2配制反应体系。

将混合液充分混合，最后加入模板，简短离心，按照下列程序进行一步法双重荧光RT-PCR反应：48 ℃ 10 min、95 ℃ 10 min进行反转录，95 ℃ 15 s变性、60 ℃ 45 s退火，44个循环扩增。

表1 新泽西型和印第安纳型水泡性口炎病毒一步法双重荧光RT-PCR检测引物和探针

表2 一步法双重荧光RT-PCR反应体系

1.6 标准曲线绘制和最低检测限确定

分别将已知浓度的VSV-NJ和VSV-IND阳性质控品按照10-1～10-11进行10倍梯度稀释后进行荧光RT-PCR反应，用模板浓度-荧光Ct值做单荧光RT-PCR浓度标准曲线，最高稀释倍数能检测出的Ct值所对应的浓度即为单荧光RT-PCR最低检测限。

再将已知浓度的VSV-NJ和VSV-IND阳性质控品等量混合，按照10-1～10-11进行10倍梯度稀释后进行双重荧光RT-PCR反应，用模板浓度-荧光Ct值做双重荧光RT-PCR浓度标准曲线，最高稀释倍数能检测出的Ct值所对应的浓度即为双重荧光RT-PCR最低检测限。

1.7 特异性测试

选择实验室保存备用的猪流感病毒（SIV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪水泡病病毒（SVDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻黏膜病毒（BVDV）、牛地方流行性白血病病毒（EBLV）、口蹄疫病毒（FMDV）、蓝舌病病毒（BTV）等9种病毒质控品，分别用VSV-NJ和VSV-IND的引物和探针进行单荧光RT-PCR，验证引物和探针的特异性。

用建立的双重荧光RT-PCR反应体系同时对上述9种病毒质控品进行检测，验证引物和探针混合后双重反应体系的特异性。

1.8 双重荧光RT-PCR和单荧光RT-PCR比较

将VSV-NJ和VSV-IND阳性质控品等量混合后进行10倍梯度稀释，分别进行双重荧光RTPCR和单荧光RT-PCR，将相同浓度模板对应的荧光Ct值进行比较，求解回归方程，比较双重荧光RT-PCR和各单荧光RT-PCR的符合性。

1.9 方法验证

用建立的双重荧光RT-PCR对细胞培养病毒核酸进行验证，对50份临床样品进行测试，并与单荧光RT-PCR进行比较。

2 结果

2.1 阳性质控品定量

将保存备用的阳性质控品，分别用紫外分光仪测定其260 nm和280 nm的吸光度值并计算出浓度和拷贝数（表3）。

2.2 标准曲线和最低检测限

分别用VSV-NJ和VSV-IND阳性质控品做浓度标准曲线。如图1所示，标准曲线PCR扩增效率E值、R2和曲线斜率均在正常范围内，说明扩增效率良好。将模板进行10-11稀释仍能检测到荧光信号，根据表3浓度，计算出对应的最低检测限在10 copies/μL左右。

VSV-NJ和VSV-IND混合质控品双重荧光RT-PCR标准曲线见图2。从图2可知，双重荧光RT-PCR扩增效率E值分别为99.5%和99.0%，R2值分别为0.999和0.998，曲线斜率均在正常范围内，说明扩增效率并没有受到双重干扰。相同稀释倍数对应的Ct值比单荧光RT-PCR略有升高，但不构成显著差异，最低检测限仍然可达10 copies/μL。

2.3 特异性检测

单个病毒的引物和探针只能扩增出各自的病毒核酸，其他病毒模板的扩增均为阴性，表明所设计的引物和探针特异性良好。利用建立的双重荧光RT-PCR方法对VSV-NJ和VSV-IND及1.7中所列病毒进行检测，结果仅VSV-NJ和VSVIND有扩增曲线，其他病毒均无特异性扩增信号（表4），表明所建立的方法特异性良好，双重并没有对特异性产生干扰。

表3 阳性质控品纯度及含量测定

图1 VSV-NJ（A）与VSV-IND（B）的荧光RT-PCR标准曲线

图2 VSV-NJ和VSV-IND双重荧光RT-PCR标准曲线

2.4 双重荧光RT-PCR和单荧光RT-PCR比较

利用相同浓度的混合模板同时进行双重荧光RT-PCR和单荧光RT-PCR的符合性测试，回归方程计算结果显示，VSV-NJ和VSV-IND单荧光RTPCR与双重荧光RT-PCR的相关性系数R2分别为0.9997和0.9994，说明双重荧光RT-PCR和各单荧光RT-PCR的符合性良好，对于相同浓度的模板，其Ct值基本一致，所有引物和探针放在一个反应体系混合后并没有相互干扰（图3）。

图3 VSV-NJ（A）和VSV-IND（B）单荧光RT-PCR与双重荧光RT-PCR的比较

表4 特异性检测结果

2.5 验证

利用本研究建立的双重荧光RT-PCR对本实验室保存的2份VSV-NJ和2份VSV-IND细胞培养病毒核酸进行检测，结果均为阳性；对50份临床样品的筛查结果均为阴性，与单荧光RT-PCR检测结果一致。

3 讨论

VS是人兽共患传染病，多种动物易感，常见于马、骡、牛、猪和野生动物，羊一般不发生自然感染，不同动物感染临床症状相似。VSV的2个血清型VSV-NJ和VSV-IND对易感动物的感受性不同，其中马、牛、猪是VSV-NJ的主要自然宿主，而马和牛经常感染VSV-IND，但猪一般不感染VSV-IND[1-2]。VSV的诊断主要靠血清学和分子生物学方法，ELISA方法是使用最广泛的血清学试验，但不能区分VSV的两个血清型，而这两个血清学感染后症状相同，临床上难以区分[1-2]。因此，本研究借助不同血清型的特异性基因序列，设计了针对两个血清型的特异性引物和探针，建立了可以同步检测和鉴别VSV-NJ和VSV-IND的双重荧光RT-PCR方法。

该方法与Hole、Femandez等[4-6]人的研究方法相比，最低检测限可达10 copies/μL，达到了目前荧光PCR技术的较好敏感性指标[7，11-12]；特异性为100%，不管是单模板，还是混合模板，引物和探针均只能扩增出各自的目标病原，其他相关病毒测试均未见非特异性扩增；结果表明，建立的双重荧光RT-PCR与单荧光RT-PCR检测结果一致，可快速、同步检测VSV-NJ和VSV-IND，从而为VS的防控工作提供了技术储备。