基于GC-MS的异翅亚目臭腺分泌物化学分类学分析

张 嫣,夏 炎,陈企发,卜文俊,*

(1.南开大学生命科学学院昆虫学研究所,天津 300071;2.南开大学化学学院南开大学中心实验室， 天津市生物传感与分子识别重点实验室,天津 300071)

异翅亚目昆虫一般称为“蝽类”，属于昆虫纲半翅目。该类群为不完全变态昆虫，种类繁多、分化强烈，目前已知多达90科45 000余种 (Henry,2017)。异翅亚目的7个次目中，陆生的臭虫次目和蝽次目是异翅亚目中分化较为晚近的类型，在基于分子及形态数据的多个分析结果中，这两类昆虫均体现为姐妹群关系(Schuh,1979;Schaefer,1993;Schuhetal.,1993;Henry,1997;Wang YHetal.,2016)。其中蝽次目被认为是单系群，常用的分类系统为包括5总科的系统[扁蝽总科、蝽总科、缘蝽总科、长蝽总科和红蝽总科] (Schaefer,1993;Schuh and Slater,1995)或6总科系统[扁蝽总科、蝽总科、缘蝽总科、长蝽总科、红蝽总科和南蝽总科] (Henry,1997;Weirauchetal.,2018)。

成虫胸部具臭腺是半翅目异翅亚目昆虫独有的特征。通常，成虫的臭腺开口于后胸侧板，称为后胸臭腺，而若虫的臭腺开口位于腹部的背面，称为腹部背臭腺。一些成虫的腹部背面也具有臭腺，但通常是退化的(Davidová-Vilímováetal.,2013)。异翅亚目的单系性一定程度上是基于臭腺的存在(Schuh and Slater,1995)。成虫的后胸臭腺通常是由一个中间储蓄泡和成对的侧腺组成。臭腺的传输系统主要由内部传输系统和外部传输系统组成。内部传输系统包含内孔和前厅，外部传输系统由孔口、近孔凹陷、孔缘和蒸发域组成。当受到惊扰或者捕食者攻击时，臭腺内部传输系统释放由臭腺腺体产生的防御性分泌物，并由外部传输系统完成喷射过程(Williamsetal.,2001)。

臭腺分泌物通常是短链的醇类、醛类、环氧醛类、酮类、酯类、烷烃类、有机酸类、单萜类和芳香类的醇或醛类。臭腺分泌物的组分可能会随虫体的生理、营养条件和发育情况及季节而变化(Aldrich,1988;Millar,2005;Nixonetal.,2018)。异翅亚目臭腺分泌物可以作为种内交流的信号(Lockwood and Story,1985;Fucarinoetal.,2004)，其更重要的作用表现在防御捕食者和抵御微生物方面(Ishiwatari,1974;Aldrich,1988,1995;Schuh and Slater,1995;Millar,2005;Moraesetal.,2008;Noge,2015)。

关于臭腺分泌物的提取方法，按照样品的获取方式，主要分为两种，离体提取法和活体提取法(Djozanetal.,2005;Hassanietal.,2010)。离体提取法主要通过解剖腺体，采用液体浸提或固体进样的技术获得；活体提取法主要是通过获取活体昆虫样品，进而采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)的方法分析获得分泌物化学组分。离体分析耗时长，且通常会伴随有溶剂的干扰。所以随着分析手段的不断进步，利用活体分析方法采用固相微萃取偶联气相色谱-质谱(GC-MS)的技术，由于分析有效、简单、快速，被广泛应用(Zhang and Pawliszyn,1993;Zhangetal.,1994;Djozanetal.,2005)。

据作者统计，蝽象中已测定臭腺分泌物的种类不足已知类群数量的1%，并且，相关的天然化学成分测定的研究进展情况难以保证分类应用的准确性，限制了其在昆虫分类中的应用。本研究从定性和定量的角度综合考虑，选取异翅亚目8个总科32种蝽象，对臭腺分泌物进行了初步比较分析。研究的开展可以丰富我们对异翅亚目昆虫臭腺分泌物组分的了解，有助于探索这些化学组分在分类学和进化生物学上的意义和价值。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本研究用于臭腺分泌物成分分析的活体标本均为野外采集获取，于2016年6月至2019年8月采集于我国的东北、华北及华中等地区。类群涉及蝽次目蝽总科5科15属15种，缘蝽总科3科6种，长蝽总科2科4种，扁蝽总科1科2种；臭虫次目2总科2科3属3种，黾蝽次目1科2种，详见表1。

表1 臭腺分泌物测定类群所用标本信息Table 1 Specimen information of species tested

1.2 臭腺分泌物收集和分析

由于对臭腺分泌物采用活体分析方法较离体分析可以更高质量地检测到分泌物(Hassanietal.,2010)，所以本实验采用固相微萃取(SPME)装置(青岛贞正分析仪器有限公司采购)偶联气相色谱-质谱仪(GC-MS)(赛默飞Trace 1300-ISQ LT)进行测定分析，可以有效排除溶剂溶解造成的干扰。

1.2.1臭腺分泌物收集：将野外现场采集的活性强的供试昆虫活体标本，迅速放入制作好的气体收集瓶中(有滤纸作载体)，做震摇处理。保证虫体处于生命体征活跃的状态，使其较充分地释放臭腺分泌物。分泌物采集完后，将虫体取出，保存在100%的乙醇溶液中，并与气味样品一对一做好标记。

在光学显微镜(OLYMPUS BX53)下对标本进行分类鉴定，将所采集的分泌物样品保存在-20℃冰箱中，直至分析进样。

1.2.2萃取针活化：将SPME探针插入GC进样口250℃活化5 min (首次使用要在GC进样口250℃作老化处理60 min)。本研究所用固相微萃取探针(ZZ-SPME-06)购自青岛贞正分析仪器有限公司，其萃取材质为活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(ACAR/PDMS/DVB)复合涂层，为双极性萃取层，适合较宽范围挥发性有机物，有利于对未知组分的研究探索(Krajiceketal.,2016)。

1.2.3臭腺分泌物富集：调整固相微萃取装置，使温度设置并保持在40℃(该温度下SPME的吸附水平高)。将活化后的固相微萃取针管逐个插入样品瓶中，推动手柄杆，伸出探针萃取头，不加任何溶剂，使瓶子保证密封状态，萃取40 min到达平衡相(对同一物种的多个样品，通过富集的方式进行样品处理),并设置空白对照试验。

1.2.4气味测定分析：GC条件：色谱柱为TG-5MS,规格为30 m×0.25 mm,0.25 mm。柱箱温度在40℃下运行1 min，然后以10℃/min升高至250℃，并在该温度下保持10 min。载气是氦气，载气气流为1 mL/min。进样口采用分流方式，分流比为1∶10。进样器和传输线温度均保持在250℃。

MS条件：离子源为电离电压为70 eV的标准EI源。质谱数据采集模式为全扫描，扫描离子范围为19～500 amu。

1.3 分泌物组分的初步定性

将实验测定的不同样品的臭腺分泌物结果，去除背景信号，先与标准谱库(NIST 2018数据库)的质谱图进行比对，筛选相似性指数SI>800 (即匹配度>80.0%)且相对含量>0.01%的化合物。对关键性的化合物需参照文献记录进行二次比对，进而完成测定结果中化合物种类的初步定性。

1.4 数据分析

将测定结果中化合物对应的TIC离子流图中的原始峰面积进行标准化处理，最后建立分析用化合物结构矩阵(雌雄样品当不同实体对待)。用SPSS 25软件(IBM,Armonk,NY) 进行判别分析；非参数多元方差分析采用PAST 3.24版本软件，不同类群间的差异分析用F检验。用Genstat软件(Release 20;VSN International,Hemel Hempstead,英国)进行典型变量分析。其中，化合物对应的原始峰面积的标准化转化公式如下：

zip=ln[Aip/g(Ap)]。

式中，Aip指类群p分析测得的峰i的峰面积，g(Ap)指类群p中测得的所有峰面积的平均值，zip即该类群p测定结果中峰i经过转化后对应的峰面积(Aitchison,1986;Geiselhardtetal.,2012;Xueetal.,2018)。由于零值的对数是无法计算的，所以在每个相对峰面积上添加0.01，以便在缺少某些化合物的结果中可以采用该公式去进行计算转换(Geiselhardtetal.,2009)。为了找出对8个总科分类起重要作用的化合物，采用典型变量分析，找到起关键作用的分泌物化合物线性组合，并依据变量化合物的相关系数找到关键性变量；然后，结合典型判别分析结果，筛选划分各总科的主要分泌物组分。

2 结果

2.1 异翅亚目臭腺分泌物组分

采用固相微萃取进样方法偶联气相色谱质谱仪对蝽次目8个总科32种的臭腺分泌物进行检测，结果共得到202种假设性化合物(表2)，包括酸类(acids)、醇类(alcohols)、醛类(aldehydes)、烷类(alkanes)、烯类(alkenes)、酰胺类(amides)、芳香类(aromatics)、萜类(terpenes)、环类(cyclics)、酯类(esters)、酮类(ketones)、肟类(oximes)和胲类(hydroxylamines)共13类(表2)，碳链长度4～34个不等。

2.2 臭腺分泌物在总科阶元分类中的价值

基于202种化合物(表2)，我们将8个总科间的化合物作典型判别分析，结果表明，臭腺分泌物在总科间存在显著差异(Wilks’s λ=0.000,χ2=454.819,P<0.001) (表3)，其中第一个函数可解释81.7%的变异，第二个函数可解释的变异为10.7% (表4)。依据典型判别分析做出的散点图(图1)显示，原始分类方案中96.6%的分类是正确的，即8个总科(蝽总科、缘蝽总科、长蝽总科、红蝽总科、扁蝽总科、盲蝽总科、猎蝽总科、黾蝽总科)的物种大都分别显著地聚簇在一起，该结果与以往的分类系统是一致的(Henry,2017)。

图1 异翅亚目8个总科臭腺分泌物化学指纹组分判别分析结果Fig.1 Discriminant analysis of the scent gland secretion profiles in eight superfamilies of HeteropteraPen.:蝽总科Pentatomoidea;Cor.:缘蝽总科Coreoidea;Lyg.:长蝽总科Lygaeoidea;Pyrr.:红蝽总科Pyrrhocoroidea;Ara.:扁蝽总科Aradoidea;Mir.:盲蝽总科Miroidea;Rev.:猎蝽总科Reduvioidea;Ger.:黾蝽总科Gerrroidea.

表2 实验测得及在总科阶元判别分析用假设性化合物Table 2 All tentative secretions gained and used in canonical discriminant analysis at the superfamily level

续表2Table2continued化合物Chemicalcompounds分子式Formula类型Groups函数Functions12345673,3a,4,5,6,6a-六氢化-3a,4,4-三甲基-3,5-甲醇环戊吡唑3,3a,4,5,6,6a-Hexahydro-3a,4,4-trimethyl-3,5-methanocyclopentapyrazoleaC10H16N2环类Cyclics0.1170.0810.224∗-0.047-0.0520.0030.0954,6,8-三甲基-1-壬烯4,6,8-Trimethyl-1-noneneaC12H24烯类Alkenes0.105-0.0130.217∗-0.074-0.072-0.1150.027壬烷NonaneaC9H20烷类Alkanes-0.0300.0070.215∗-0.0790.032-0.0220.024(E)-2-癸烯醛(E)-2-DecenalC10H18O醛类Aldehydes-0.004-0.0270.211∗-0.1450.0570.0330.071(E)-3-丙-2-烯亚基环丁烯(E)-3-Propyl-2-propenylidene-cyclobuteneaC7H8环类Cyclics0.1550.024-0.211∗0.1660.0640.0710.108香芹酚2-Methyl-5-(1-methylethyl)-phenolaC10H14O芳香类Aromatics-0.1790.0030.189∗-0.0860.1150.0130.027十二醛DodecanalC12H24O醛类Aldehydes0.002-0.004-0.189∗0.0620.065-0.032-0.0372,4,6-三甲基庚烷2,4,6-Trimethyl-heptaneaC10H22烷类Alkanes-0.1790.0070.187∗-0.0820.1200.0180.030月桂烯β-MyrceneC10H16萜类Terpenes-0.135-0.0030.175∗-0.0860.0910.0110.0283-甲基己烷3-Methyl-hexaneaC7H16烷类Alkanes-0.132-0.001-0.164∗-0.0220.0600.0300.0764-甲基-2-羟基-2-苯丙基苯甲酸酯4-Methyl-,2-hydroxy-2-phenylpropylester,benzoicacidaC17H18O3酯类Esters-0.132-0.003-0.164∗-0.0230.0590.0290.075O-癸基羟胺O-decyl-hydroxylamineaC10H23NO胲类Hydroxylamines0.0450.1050.154∗-0.029-0.0260.1170.057丁酸ButanoicacidC4H8O2酸类Acids0.0030.002-0.119∗-0.032-0.067-0.0760.0792-溴十二烷2-BromododecaneaC12H25Br烷类Alkanes-0.0130.0420.116∗-0.0700.103-0.0090.078甲基环戊烷Methyl-cyclopentaneaC6H12烷类Alkanes-0.073-0.0150.111∗-0.0960.031-0.0220.0512-乙基-1-己醇2-Ethyl-1-HexanolC6H4Cl2芳香类Aromatics0.0480.0110.097∗-0.0350.0000.0010.0272-癸烯-1-醇2-Decen-1-olC10H20O醇类Alcohols-0.012-0.0040.089∗-0.0600.0440.0310.040(E)-2-辛烯醛(E)-2-OctenalC8H14O醛类Aldehydes-0.013-0.0030.071∗-0.0500.0390.0280.034(E)-2-癸烯醛(E)-2-DecenalC10H18O醛类Aldehydes0.0000.0100.058∗-0.0300.0350.0270.0329-辛基十七烷9-Octyl-heptadecaneaC25H52烷类Alkanes0.0000.0110.054∗-0.0270.0350.0280.031(1R,2R)-rel-2-甲基环戊醇(1R,2R)-rel-2-Methyl-cyclopentanolC6H12O醇类Alcohols0.0000.0130.054∗-0.0260.0380.0300.0333-甲基十六烷3-Methyl-hexadecaneaC17H36烷类Alkanes0.0000.0140.054∗-0.0260.0380.0310.033(E)-5-十三烯(E)-5-TrideceneaC13H26烯类Alkenes0.0000.0120.052∗-0.0260.0350.0280.031乙酸己酯Aceticacid,hexylesteraC8H16O2酯类Esters-0.025-0.0230.2220.561∗0.019-0.040-0.253己酸己酯Hexanoicacid,hexylesteraC12H24O2酯类Esters-0.094-0.0680.1210.477∗0.051-0.015-0.198邻苯二甲酸二丁酯DibutylphthalateaC16H22O4酯类Esters0.3490.174-0.098-0.374∗0.2900.0790.0033-甲基戊酸乙酯3-Methyl-,ethylester,pentanoicacidaC8H16O2酯类Esters-0.179-0.056-0.0800.364∗0.023-0.052-0.121萘NaphthaleneaC10H8芳香类Aromatics0.1370.019-0.0100.337∗-0.0220.025-0.2731,2,3,5-四氢化-1,3-羟甲基戊二烯1,2,3,5-Tetrahydro-1,3-methanopentaleneaC9H10环类Cyclics-0.1190.035-0.011-0.259∗-0.196-0.111-0.1451-亚甲基-1H-茚1-Methylene-1H-indeneaC10H8芳香类Aromatics-0.150-0.094-0.089-0.255∗-0.075-0.0950.1092,7,10-三甲基十二烷2,7,10-Trimethyl-dodecaneaC15H32烷类Alkanes-0.155-0.076-0.0310.227∗-0.088-0.0960.001十一烷UndecaneaC11H24烷类Alkanes-0.1230.1740.058-0.214∗0.1400.1080.1004-三氟乙酸十六烷4-TrifluoroacetoxyhexadecaneaC18H33F3O2酯类Esters0.073-0.087-0.081-0.205∗0.174-0.0320.059邻二甲苯O-xyleneaC8H10芳香类Aromatics0.149-0.081-0.1640.201∗-0.084-0.0220.001十四烷TetradecaneaC14H30烷类Alkanes0.1260.106-0.147-0.189∗-0.174-0.037-0.0132-茨醇BorneolC10H18O醇类Alcohols0.027-0.109-0.067-0.045-0.145∗-0.096-0.0793-甲基戊烷3-Methyl-pentaneC6H14烷类Alkanes0.003-0.0030.026-0.053∗-0.003-0.0130.052丙基苯Propyl-benzeneaC11H24芳香类Aromatics-0.0120.096-0.2470.289-0.352∗-0.288-0.1662,6,11-三甲基十二烷2,6,11-Trimethyl-dodecaneaC15H32烷类Alkanes-0.023-0.1210.0130.0630.322∗-0.0400.0982-甲基十八烷2-Methyl-octadecaneaC19H40烷类Alkanes0.1870.122-0.067-0.1290.315∗0.0190.033苯酚PhenolaC6H6O芳香类Aromatics0.116-0.0340.074-0.256-0.310∗-0.029-0.034甲苯TolueneaC7H8芳香类Aromatics0.0390.1080.2010.028-0.285∗-0.1450.051二十烷EicosaneaC20H42烷类Alkanes-0.146-0.031-0.1400.013-0.258∗-0.0130.0372-甲基十九烷2-Methyl-nonadecaneaC20H42烷类Alkanes-0.1510.020-0.023-0.0590.246∗-0.1130.053

续表2Table2continued化合物Chemicalcompounds分子式Formula类型Groups函数Functions12345673,7-二甲基-2-辛烯-1-醇3,7-Dimethyl-2-octen-1-olC10H20O醇类Alcohols-0.0290.015-0.0110.0610.234∗-0.0650.053异蒲勒醇CoolactC10H18O萜类Terpenes-0.0020.024-0.0110.174-0.214∗-0.1800.0342,6,10,15-四甲基十七烷2,6,10,15-Tetramethyl-heptadecaneaC21H44烷类Alkanes-0.0040.0600.1360.0220.208∗0.0030.1852,2,4-三甲基-3-羧基异丙基,异丁基酯,戊酸2,2,4-Trimethyl-3-carboxyisopropyl,isobutylester,pentanoicacidaC16H30O4酯类Esters-0.0090.0520.0230.0360.207∗-0.0080.134(E)-2-己烯醛(E)-2-HexenalaC6H10O醛类Aldehydes0.0520.0280.0410.0700.193∗-0.1080.0462,6-二甲基壬烷2,6-Dimethyl-nonaneaC11H24烷类Alkanes-0.0640.107-0.0870.013-0.178∗-0.108-0.004乙基苯EthylbenzeneaC8H10芳香类Aromatics0.005-0.104-0.0500.000-0.174∗-0.124-0.1382,3,5,8-四甲基癸烷2,3,5,8-Tetramethyl-decaneaC14H30烷类Alkanes-0.143-0.0210.133-0.1050.170∗0.0550.126(E)-(3,3-二甲基亚环己基)-,乙醛(E)-(3,3-Dimethylcyclohexylidene)-,acetaldehydeaC10H16O萜类Terpenes0.005-0.101-0.035-0.004-0.170∗-0.126-0.134乙酰苯AcetophenoneaC8H8O芳香类Aromatics0.001-0.088-0.0650.023-0.169∗-0.123-0.1382,6-二甲基十一烷2,6-Dimethyl-undecaneaC13H28烷类Alkanes0.047-0.033-0.0940.035-0.169∗0.0500.012茴香酮L-FenchoneaC10H16O萜类Terpenes-0.004-0.058-0.0900.032-0.162∗-0.1480.065(-)-柠檬烯(S)-1-Methyl-4-(1-methylethenyl)-,cyclohexeneaC10H20O萜类Terpenes-0.0010.0180.0190.119-0.159∗-0.1350.037(E)-2-己烯-1-醇(E)-2-Hexen-1-olC6H12O醇类Alcohols0.0030.110-0.0180.0110.151∗-0.044-0.042(E,E)-2,4-己二烯醛(E,E)-2,4-HexadienalC6H8O醛类Aldehydes-0.0020.0230.031-0.0080.041∗0.0350.0312-乙基-2-甲基十三醇2-Ethyl-2-methyl-tridecanolaC16H34O醇类Alcohols-0.0020.0230.032-0.0080.041∗0.0350.031(E,E)-2,4-癸二烯醛(E,E)-2,4-DecadienalC10H16O醛类Aldehydes-0.0170.0060.037-0.0260.041∗0.0320.0291-十五烯1-PentadeceneaC15H30烯类Alkenes-0.0020.0220.032-0.0090.041∗0.0350.031(E)-2-十四烯-1-醇E-2-Tetradecen-1-olaC14H28O醇类Alcohols-0.0020.0220.032-0.0090.040∗0.0340.0312,4-二甲基-2,3-庚二烯-5-炔2,4-Dimethyl-2,3-heptadien-5-yneaC9H12烯类Alkenes-0.0020.0220.032-0.0090.040∗0.0340.0302,2-二氯-2-氟-1-苯乙酮2,2-Dichloro-2-fluoro-1-phenyl-ethanoneaC8H5Cl2FO芳香类Aromatics-0.0020.0210.032-0.0090.040∗0.0340.030(Z)-7-十六碳烯(Z)-7-HexadeceneaC16H32烯类Alkenes-0.0020.0210.032-0.0090.040∗0.0340.030(1R,2S,3S)-rel-2-甲基-3-(1-异丙烯基)环己醇(1R,2S,3S)-rel-2-Methyl-3-(1-methylethenyl)-cyclohexanolC10H18O萜类Terpenes-0.0020.0210.032-0.0100.039∗0.0330.030(1α,2α,3β,6α)-3,7,7-三甲基-,双环[4.1.0]庚-2-醇(1α,2α,3β,6α)-3,7,7-Trimethyl-,bicyclo[4.1.0]heptan-2-olaC10H18O醇类Alcohols-0.0020.0210.032-0.0100.039∗0.0330.030(Z)-6-十三烯(Z)-6-TrideceneaC13H26烯类Alkenes-0.0020.0210.032-0.0090.039∗0.0330.030(E)-14-十六烯醛E-14-HexadecenalaC16H30O醛类Aldehydes-0.0020.0210.032-0.0100.039∗0.0330.0306-甲基十八烷6-Methyl-octadecaneaC19H40烷类Alkanes-0.0020.107-0.0410.0700.393-0.398∗-0.076十二烷DodecaneaC12H26烷类Alkanes0.166-0.198-0.091-0.0980.248-0.324∗0.0588-丙氧基柏木烷8-Propoxy-cedraneaC18H32O萜类Terpenes-0.005-0.0160.042-0.029-0.1770.321∗0.097碳酸,癸基十一基酯Carbonicacid,decylundecylesteraC22H44O3酯类Esters0.115-0.186-0.1430.070-0.175-0.247∗0.0262,6-二甲基癸烷2,6-DimethyldecaneaC12H26烷类Alkanes-0.1310.184-0.055-0.044-0.152-0.246∗-0.236(2Z)-3-乙基-2,4-戊二烯-1-醇(2Z)-3-Ethyl-2,4-pentadien-1-olC7H12O醇类Alcohols-0.0010.127-0.0460.016-0.0120.240∗0.001(1S,4R,6R)-4-异丙烯基-1-甲基-7-氧杂双环[4.1.0]庚烷cis-LimoneneoxideaC10H16O环类Cyclics-0.0010.123-0.0450.017-0.0080.230∗0.003愈创木酚磺酸钾-1(10),11-二烯Guaia-1(10),11-dieneaC15H24萜类Terpenes-0.0010.122-0.0440.016-0.0100.229∗0.002α-蒎烯α-CopaeneaC15H24萜类Terpenes-0.0010.121-0.0440.016-0.0110.229∗0.001β-蒎烯β-CopaeneaC15H24萜类Terpenes-0.0010.121-0.0440.016-0.0110.228∗0.0011R,3Z,9S-4,11,11-三甲基-8-亚甲基双环[7.2.0]-十四醛-3-烯1R,3Z,9S-4,11,11-Trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-3-eneaC15H24萜类Terpenes-0.0010.121-0.0440.016-0.0110.228∗0.001斯巴醇SpathulenolaC15H24O醇类Alcohols0.0000.121-0.0440.015-0.0110.228∗0.0016-epi-白菖醇6-Epi-shyobunolaC15H26O萜类Terpenes0.0000.121-0.0440.015-0.0120.228∗0.001(E)-β-金合欢烯(E)-β-FameseneaC15H24萜类Terpenes0.0000.120-0.0440.015-0.0120.228∗0.000

续表2Table2continued化合物Chemicalcompounds分子式Formula类型Groups函数Functions1234567β-衣兰烯β-YlangeneaC15H24萜类Terpenes0.0000.120-0.0440.015-0.0130.227∗0.000石竹烯CaryophylleneaC15H24萜类Terpenes0.0000.119-0.0440.014-0.0140.227∗0.000(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基双环[8.1.0]十一烷-2,6-二烯(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-Tetramethylbicyclo[8.1.0]undeca-2,6-dieneaC15H24萜类Terpenes0.0000.119-0.0430.014-0.0150.226∗-0.001(1R,2S,6S,7S,8S)-rel-8-异丙基-1-3-亚甲基三环[4.4.0.02,7]癸烷(1R,2S,6S,7S,8S)-rel-8-Isopropyl-1-methyl-3-methylenetricyclo[4.4.0.02,7]-decaneaC15H24萜类Terpenes0.0000.118-0.0430.013-0.0160.226∗-0.0015-乙基-2(5H)-呋喃酮5-Ethyl-2(5H)-furanoneaC6H8O2环类Cyclics0.0880.0230.0580.0180.131-0.226∗-0.0451-己醇1-HexanolC6H14O醇类Alcohols0.0010.006-0.0460.1720.1790.192∗0.1762,6-二甲基十七烷2,6-Dimethyl-heptadecaneaC19H40烷类Alkanes0.063-0.001-0.077-0.026-0.0860.177∗0.081甲氧基-苯基-肟Methoxy-phenyl-oximeaC8H9NO2肟类Oximes-0.0030.099-0.0350.0230.0150.172∗0.01311-(1-乙基丙基)-二十一烷11-(1-Ethylpropyl)-heneicosaneaC26H54烷类Alkanes-0.0420.036-0.070-0.027-0.1580.172∗-0.0492-己炔-1-醇2-Hexyn-1-olC6H10O醇类Alcohols-0.0030.099-0.0350.0220.0140.172∗0.013(Z)-依兰油-3,5-二烯cis-Muurola-3,5-dieneaC15H24萜类Terpenes-0.0030.096-0.0340.0230.0160.166∗0.014反式-Z-α-环氧化红没药烯trans-(Z)-α-BisaboleneepoxideaC15H24O环类Cyclics-0.0030.096-0.0340.0220.0150.166∗0.013β-罗勒烯β-OcimeneaC10H16萜类Terpenes-0.0030.095-0.0340.0220.0140.166∗0.013α-葎草烯HumuleneC15H24萜类Terpenes-0.0030.094-0.0340.0210.0130.165∗0.0124-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4-四氢化萘4-Isopropyl-1,6-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthaleneaC15H22萜类Terpenes-0.0020.093-0.0330.0210.0120.164∗0.011辛醛OctanalaC8H16O醛类Aldehydes-0.0270.001-0.0510.1230.1500.154∗0.1322,4-二叔丁基苯酚2,4-Di-tert-butylphenolaC14H22O芳香类Aromatics-0.022-0.033-0.0550.0410.032-0.150∗-0.008N,N-二甲基甲酰胺N,N-Dimethyl-formamideaC3H7NO酰胺类Amides0.0320.081-0.019-0.010-0.0220.141∗0.099对二甲苯p-XyleneaC8H10芳香类Aromatics-0.0480.059-0.0520.0100.0390.136∗0.013二氢松油醇DihydroterpineolC10H20O萜类Terpenes-0.006-0.068-0.0690.096-0.058-0.131∗-0.073己酸HexanoicacidC6H12O2酸类Acids0.0050.039-0.054-0.0320.058-0.129∗0.0224-甲基十四烷4-Methyl-tetradecaneaC15H32烷类Alkanes0.0720.0630.069-0.072-0.048-0.080∗0.0612-丙基-1-戊醇2-Propyl-1-pentanolC8H18O醇类Alcohols0.0020.042-0.034-0.021-0.0210.057∗0.0372-己基-1-辛醇2-Hexyl-1-octanolC14H30O醇类Alcohols-0.0110.0220.003-0.046-0.0030.052∗0.0422,21-二甲基二十二烷2,21-Dimethyl-docosaneC24H50烷类Alkanes0.000-0.002-0.0560.0780.0690.176-0.678∗(1α,4β,5α)-4-甲基-1-(1-甲基乙基)-双环[3.1.0]己-2-酮(1α,4β,5α)-4-Methyl-1-(1-methylethyl)-,bicyclo[3.1.0]hexan-2-oneaC10H16O萜类Terpenes0.000-0.002-0.0560.0780.0690.176-0.677∗11-癸基二十四烷11-Decyl-tetracosaneaC34H70烷类Alkanes0.007-0.029-0.0800.0630.0650.105-0.480∗1-甲基-3-丙基-苯1-Methyl-3-propyl-benzeneaC9H12芳香类Aromatics-0.1110.2470.1700.169-0.133-0.161-0.356∗1,2,4-三甲苯1,2,4-Trimethyl-benzeneaC9H12芳香类Aromatics0.079-0.069-0.0250.022-0.020-0.1070.332∗1-乙基-3-甲基苯1-Ethyl-3-methyl-benzeneaC9H12芳香类Aromatics0.043-0.124-0.1590.099-0.168-0.078-0.320∗十五烷PentadecaneC15H32烷类Alkanes0.0180.020-0.1920.137-0.095-0.026-0.303∗11-丁基二十二烷11-Butyl-docosaneaC26H54烷类Alkanes-0.001-0.0040.099-0.074-0.0810.1190.295∗葑酮FenchoneaC10H16O萜类Terpenes0.004-0.0140.049-0.0160.0390.080-0.278∗鸢醇PlinolAC10H18O醇类Alcohols0.011-0.051-0.0550.079-0.094-0.022-0.271∗二十四烷TetracosaneaC24H50烷类Alkanes0.0090.092-0.117-0.0220.125-0.1010.265∗樟脑CamphoraC10H16O萜类Terpenes-0.0490.1150.092-0.231-0.094-0.006-0.254∗2-甲基癸烷2-Methyl-decaneaC11H24烷类Alkanes-0.031-0.0770.047-0.0060.0190.0300.197∗(1-甲基戊基)环丙烷1-MethylpentylcyclopropaneaC9H18烷类Alkanes-0.012-0.1020.109-0.007-0.1640.0500.185∗异葑醇IsofencholC10H18O醇类Alcohols0.017-0.076-0.1280.015-0.0050.049-0.173∗庚醛HeptanalC7H14O醛类Aldehydes0.007-0.0700.0570.029-0.167-0.106-0.173∗3,7-二甲基癸烷3,7-Dimethyl-decaneC12H26烷类Alkanes-0.0060.001-0.157-0.0070.039-0.0620.168∗

续表2Table2continued化合物Chemicalcompounds分子式Formula类型Groups函数Functions1234567苯甲醛BenzaldehydeaC7H6O芳香类Aromatics-0.047-0.1050.0240.057-0.091-0.143-0.167∗4,7-二甲基十一烷4,7-Dimethyl-undecaneaC13H28烷类Alkanes0.136-0.0530.017-0.0730.1560.0840.158∗高蒎醇cis-PinenehydrateC10H18O醇类Alcohols0.008-0.025-0.0790.003-0.004-0.0080.141∗2,6-二甲基-6-三氟醚乙酰氧基辛烷2,6-Dimethyl-6-trifluoroacetoxyoctaneaC12H21F3O2酯类Esters0.0510.0520.0370.0060.0210.0780.114∗糠醛FurfuralC5H4O2环类Cyclics0.021-0.086-0.0580.008-0.105-0.052-0.109∗冰片2-BornanolC10H18O醇类Alcohols0.004-0.0110.0510.097-0.038-0.0220.103∗2-乙烯基-二环[2.1.1]-己-2-烯2-Ethenyl-bicyclo[2.1.1]hex-2-eneaC8H10环类Cyclics-0.0170.0480.025-0.0520.018-0.0480.064∗2-甲基-2-十一烷硫醇2-Methyl-2-undecanethiolC12H26S醇类Alcohols0.0030.0000.024-0.0510.000-0.0100.054∗4,8-二甲基-1-壬醇4,8-Dimethyl-1-nonanolC11H24O醇类Alcohols0.0010.008-0.029-0.028-0.013-0.0210.054∗2-异丙基-5-甲基-1-庚醇5-Methyl-2-(1-methylethyl)-1-heptanolC11H24O醇类Alcohols0.0020.0030.002-0.041-0.005-0.0140.052∗2-甲基己烷2-Methyl-hexaneC7H16烷类Alkanes0.0020.0020.003-0.042-0.006-0.0150.052∗

表3 判别函数的显著性水平检验Table 3 Significance level test of functions

表4 前两个典型判别式函数的相关特征值Table 4 Correlation eigenvalues in the first two typical discriminant functions

非参数多元方差分析的结果同样支持总科间臭腺分泌物组分之间存在显著差异(F=0.92218,P<0.001)；分析结果认为性别之间差异不显著(F=0.49723,P=0.1092)。

此外，依据函数的典型判别分析中所用的化合物结构矩阵(表2)可以看出，对这8个总科分类表现为差异分化的变量化合物有：酸类、醇类、醛类、烷类、萜类、环类共6类48种，占总测定分析结果中的比例为23.76%。这6类化合物中对8个总科的分类起关键作用的组分见表5。酸类物质：丁酸(butanoic acid) (匹配度：89.6%)、2-己烯酸(2-hexenoic acid)(86.8%)、己酸(hexanoic acid)(83.9%)是直链的脂肪酸；醇类化合物中有环状的(1R,2R)-rel-2-methyl-cyclopentanol (80.0%)、斯巴醇(spathulenol) (89.6%)、鸢醇(plinol A) (83.2%)、异葑醇(isofenchol) (80.0%)、2-茨醇(borneol) (91.3%)，也有直链或具支链的脂肪醇2-癸烯-1-醇(2-decen-1-ol) (85.8%)、3,7-二甲基-2-辛烯-1-醇(3,7-dimethyl-2-octen-1-ol) (81.7%)、2-丁基-1-辛醇(2-butyl-1-octanol) (82.5%)、2-乙基-1-己醇(2-ethyl-1-hexanol) (93.1%)、(6Z,9Z)-十五烷-1-醇[(6Z,9Z)-pentadecadien-1-ol] (83.1%)、(2Z)-3-乙基-2,4-戊二烯-1-醇[(2Z)-3-ethyl-2,4-pentadien-1-ol(82.7%)、1-己醇(1-hexanol)(81.2%)、2-己基-1-辛醇(2-hexyl-1-octanol) (82.4%)、4,8-二甲基-1-壬醇(4,8-dimethyl-1-nonanol) (80.5%)、5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)-1-庚醇[5-methyl-2-(1-methylethyl)-1-heptanol] (83.3%)、2-甲基-2-十三烷硫醇[2-methyl-2-undecanethiol) (81.7%)]。醛类：(Z)-2-癸烯醛[(Z)-2-decenal] (92.1%)、十二醛(dodecanal) (84.6%)、(E)-2-辛烯醛[(E)-2-octenal] (81.4%)、(E)-2-癸烯醛[(E)-2-decenal] (91.3%)、(E)-4-氧代己-2-烯醛[(E)-4-oxo-2-hexenal] (90.7%)、2-己烯醛(2-hexenal) (83.7%)、(Z)-3-己烯醛[(Z)-3-hexenal] (85.2%)、(E,E)-2,4-己二烯醛[(E,E)-2,4-hexadienal] (85.8%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛[(E,E)-2,4-decadienal] (81.9%)、庚醛(heptanal) (87.2%)和烷类物质3-甲基戊烷(3-methyl-pentane) (89.7%)、2,21-二甲基二十二烷(2,21-dimethyl-docosane) (83.0%)、3,7-二甲基癸烷(3,7-dimethyl-decane) (87.1%)、2-二甲基己烷(2-methyl-hexane) (81.3%))均是直链或具支链的脂肪族化合物；萜类有单环异蒲勒醇(coolact)(81.7%)、二氢香芹醇(neodihydrocarveol)(81.8%)、(1R,2S,3S)-rel-2-甲基-3-(1-异丙烯基)-环己醇(80.7%)、α-葎草烯(humulene) (80.8%)、二氢松油醇(dihydroterpineol) (90.6%)和十氢-1-甲基萘(1-methyldecalin) (80.1%)、(1R,2S,4R,6S)-4,7,7-三甲基-双环[4.1.0]庚烷(83.8%)两种类型；环类化合物糠醛(2-furancarboxaldehyde) (81.1%)既有醛基又含有一个不饱和杂环。

表5 划分8个总科的关键性化合物Table 5 Key chemical compounds for classification of the eight superfamilies

续表5 Table 5 continued

2.3 典型变量分析区分不同总科间具有差异性的臭腺分泌物

对8总科202种臭腺分泌物组分进行典型变量分析，第一维的变量形成的线性组合可解释的变异高达91.15%，其中起正向作用的化合物有10类103种，详见表6。

表6 典型变量分析结果中对8总科分类具正向作用的化合物Table 6 Compounds with largest positive loadings in eight superfamilies tested

依据组成第一维线性组合的变量化合物结合2.2节典型判别分析的结果中对8总科划分表现为差异分化的化合物，初步得出划分8个总科的主要分泌物组分共有6类30种(酸类、醇类、醛类、烷类、环类和萜类化合物)，这些化合物在不同总科中的分布情况如下：

蝽总科(Pentatomoidea)中共有6类25种，酸类物质：己酸(83.9%)、2-己烯酸(86.8%) (C6)；醇类物质：丙二醇甲醚(1-methoxy-2-propanol)(88.4%)(C4)、2-乙基-1-己醇(2-ethyl-1-hexanol)(93.1%)、(S)-3-乙基-4-甲基-1-戊醇[(3S)-3-ethyl-4-methyl-pentan-1-ol)](80.1%) (C8)、3,7-二甲基-2-辛烯-1-醇(3,7-dimethyl-2-octen-1-ol) (81.7%)、2-癸烯-1-醇(85.8%)、高蒎醇(cis-pinene hydrate) (82.7%)、异葑醇 (80.0%)、2-茨醇(91.3%)、冰片(2-bornanol) (88.1%) (C10)、4,8-二甲基-1-壬醇(80.5%) (C11)、2-丁基-1-辛醇 (C12)、2-己基-1-辛醇 (C14)、(6Z,9Z)-十五烷-1-醇(83.1%) (C15)、(9E)-9-十六碳烯-1-醇[(9E)-9-hexadecen-1-ol] (90.8%) (C16)；醛类物质：(Z)-3-己烯醛(85.2%) (C6)、(E)-2-辛烯醛(81.4%) (C8)、(E)-2-癸烯醛 (91.3%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(81.9%) (C10)、十二醛(84.6%) (C12)；烷类物质：2-二甲基己烷(81.3%) (C7)；环类物质：糠醛(81.1%) (C5)；萜类物质：二氢香芹醇(81.8%)、二氢松油醇(90.6%) (C10)。

续表6 Table 6 continued

续表6 Table 6 continued

缘蝽总科(Coreoidea)中共有6类13种，酸类物质：丁酸(89.6%) (C4)、己酸(83.9%) (C6)；醇类物质：2-乙基-1-己醇(93.1%)(C8)、高蒎醇(82.7%)、异葑醇 (80.0%)、2-茨醇(91.3%)、冰片(88.1%) (C10)、4,8-二甲基-1-壬醇(80.5%) (C11)、2-己基-1-辛醇(82.4%) (C14)；醛类物质：十二醛(84.6%) (C12)；烷类物质：2-二甲基己烷(81.3%) (C7)；环类物质：糠醛(81.1%) (C5)；萜类物质：α,α-4-三甲基环己基甲醇 (90.6%) (C10)。

长蝽总科(Lygaeoidea)中共有4类8种，酸类物质：己酸(83.9%) (C6)；醇类物质：2-己炔-1-醇(2-hexyn-1-ol)(80.1%)(C6)、2-乙基-1-己醇(93.1%)(C8)、2-丁基-1-辛醇(82.5%) (C12)、2-己基-1-辛醇(82.4%) (C14)、斯巴醇(89.6%) (C15)、醛类物质：十二醛(84.6%) (C12)；萜类物质：二氢松油醇(90.6%) (C10)。

红蝽总科(Pyrrhocoroidea)中共有4类6种，酸类物质：己酸(83.9%) (C6)；醇类物质：2-乙基1-己醇(93.1%) (C8)、3,7-二甲基-2-辛烯-1-醇(81.7%) (C10)、2-丁基-1-辛醇 (82.5%) (C12)；醛类物质：十二醛(84.6%) (C12)；萜类物质：二氢松油醇(90.6%) (C10)。

扁蝽总科(Aradoidea)中共有3类8种，醇类物质：丙二醇甲醚(88.4%)(C4)、2-乙基-1-己醇(93.1%) (C8)、2-癸烯-1-醇(85.8%) (C10)、2-己基-1-辛醇(82.4%) (C14)；醛类物质：(E)-2-辛烯醛(81.4%) (C8)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(81.9%) (C10)、十二醛(84.6%) (C12)；萜类物质：二氢松油醇(90.6%) (C10)。

盲蝽总科(Miroidea)中共有4类9种，醇类物质：1-己醇(81.2%) (C6)、2-乙基-1-己醇(93.1%) (C8)、3,7-二甲基-2-辛烯-1-醇(81.7%)、异葑醇(80.0%)、2-茨醇(91.3%) (C10)；醛类物质：十二醛(84.6%) (C12)；烷类物质：2,21-二甲基二十二烷(83.0%) (C24)；环类物质：糠醛(81.1%) (C5)；萜类物质：二氢松油醇(90.6%) (C10)。

猎蝽总科(Reduvioidea)中共有4类8种，醇类物质：2-乙基-1-己醇(93.1%) (C8)、高蒎醇(82.7%)、异葑醇(80.0%)、2-茨醇l (91.3%)、冰片(88.1%) (C10)；醛类物质：十二醛(84.6%) (C12)；环类物质：糠醛(81.1%) (C5)；萜类物质：二氢松油醇(90.6%) (C10)。

黾蝽总科(Gerroidea)中共有4类8种，醇类物质：2-乙基-1-己醇(93.1%) (C8)、高蒎醇(82.7%)、异葑醇(80.0%)、2-茨醇(91.3%)、冰片(88.1%) (C10)；醛类物质：十二醛(84.6%) (C12)；环类物质：糠醛(81.1%) (C5)；萜类物质：α,α-4-三甲基环己基甲醇(90.6%) (C10)。

3 讨论与结论

蝽以高度发达的臭腺为主要特征，当受到惊扰或者捕食者攻击时，臭腺可以对捕食者产生有效的化学防御。本实验用于分析的样品多数采用震摇惊扰后多个气味样品富集的方式，有利于获取不同虫体状态下的分泌物组分，进而尽可能平衡物种内的组分差异。本研究测得的分泌物组分中，还包含很多高分子量的关键组分(C10,C11,C12,C15,C16和C24等)，这些高分子量的化合物的存在可能更利于蝽在大量潜在的捕食者存在的情况下，发挥持久性的化学防御策略。这些用作信息交流的关键性的不同化合物及其组成的各种混合物，在昆虫中的生理机制及其所发挥的具体作用尚需要更多的实验去验证。

Farine等(1993)对红蝽科5个种和Krajicek等(2016)对红蝽科3个种的臭腺分泌物的聚类分析中，属间和属内的臭腺分泌物在物种分类上的作用仍然没有一致性的结论；Pareja等(2007)对蝽科5个种的臭腺分泌物进行化学组分的比较研究，发现臭腺分泌物在种内不同发育阶段和性别间存在差异，并且一定程度上可以反映种间亲缘关系，具有化学分类价值。本研究在更高分类阶元探讨了这一问题，在蝽次目5个总科、臭虫次目2个总科以及黾蝽次目1个总科臭腺分泌物的测定结果中，分析发现在总科阶元这些防御性的化学分泌物组分多数是保守的。测定获得的202种化合物中，除去显著划分8总科间的差异组分，保守组分占比高达76.24%。保守性的化合物可能是由于进化过程中生物合成途径的限制引起的，且在一些重要的生物学功能中发挥作用；而这些差异性的化合物，同样具有物种特异性功能。这些化合物信息可以为信息素的演化提供重要的演化信号(Blum,1985;Parejaetal.,2007)，但是关于这些多样性和保守型的化合物在不同阶元的化学分类中具有的作用及具体的生物学功能尚需进行深入的研究去发掘。

在进行性别差异分析的结果中，并没有发现分泌物的结果在性别间有显著差异，与之前Kou等(1989)、Farine等(1992a,1992b)的分析结果一致。

在对不同总科化合物的分类学研究中发现，划分8个总科且对8个总科聚类具有重要作用的主要化合物有6类：酸类、醇类、醛类、烷类、环类和萜类。其中以醇类物质种类居多，其次是醛类物质、萜类物质、酸类物质，最后是烷类物质及环类物质。这可能是由于蝽在被惊扰后，最后释放的可用作化学防御的化合物中，醇类物质、醛类物质、萜类物质和酸类物质可以发挥有效的信息素作用，如告警和聚集作用等。如本研究中的酸类物质己酸，作为蝽的后胸臭腺的典型防御性组分(Aldrichetal.,1993;Lealetal.,1994)，在缘蝽总科的研究中，发现该化合物具有告警信息素作用(Soldietal.,2012;Nogeetal.,2015)，也可以作为引诱性的信息素(Laumannetal.,2012)；在红蝽总科(Krajiceketal.,2016)、蝽总科(Durak and Kalender,2007;Martinsetal.,2012)防御性分泌物的研究中也发现了该化合物的存在。醇类物质2-癸烯-1-醇，在宽圆果蝽Carpocorisfuscispinus[蝽科(Pentatomidae)]中，被认为是性信息素(Durak and Kalender,2012)；在缘蝽总科(Waterhouse and Gilby,1964;Thouvenin,1965;Aldrich and Yonke,1975)和盲蝽总科的臭腺分泌物中有醇类物质1-己醇的存在(Wardleetal.,2003)，但是目前其生物学功能尚不明确。醛类物质(E)-2-辛烯醛在Laumann等(2012)对蛛缘蝽Neomegalotomusparvus的引诱性信息素的研究中存在。醛类物质(Z)-3-己烯醛，在红蝽总科(Krajiceketal.,2016)、蝽总科(Durak and Kalender,2007)的臭腺分泌物的研究中存在。醛类物质(E)-2-癸烯醛在红蝽总科(Farineetal.,1992a,1992b)、蝽总科(Parejaetal.,2007;Blassioli-Moraesetal.,2012;Lopesetal.,2015)中许多种的后胸臭腺分泌物中均有发现。醛类物质(E,E)-2,4-癸二烯醛在蝽总科(Parejaetal.,2007;Lopesetal.,2015;Wang YJetal.,2015)的后胸臭腺研究中有发现。

此外，本研究中发现划分总科阶元的一些关键性化合物，如醇类物质2-丁基-1-辛醇、2-己基-1-辛醇、2-己炔-1-醇、3,7-二甲基-2-辛烯-1-醇、4,8-二甲基-1-壬醇、高蒎醇、丙二醇甲醚、2-乙基-1-己醇、(6Z,9Z)-十五烷-1-醇、(E)-十六碳烯-1-醇、(3S)-3-乙基-4-甲基-1-戊醇、异葑醇、冰片、斯巴醇；醛类物质十二醛；烷类物质2-二甲基己烷和2,21-二甲基二十二烷；环类物质糠醛；以及萜类物质2-茨醇、α,α-4-三甲基环己基甲醇在臭腺分泌物的测定分析中均为首次发现，它们在不同类群中发挥的作用尚需深入研究。