节肢动物内共生菌Wolbachia的研究进展

朱翔宇,尤士骏,*,刘天生,张 玲,尤民生

(1.福建农林大学应用生态研究所,闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室,福州350002; 2.福建农林大学,教育部害虫生态防控国际合作联合实验室,福州 350002; 3.福建农林大学,农业部闽台作物有害生物综合治理重点实验室,福州 350002)

节肢动物体内存在着种类繁多的微生物，这些微生物分布于节肢动物的不同器官或部位，包括节肢动物的肠道、生殖系统等。微生物与其宿主间的共生关系十分复杂，同时受到各种环境因素和宿主遗传背景的影响；许多微生物对宿主也具有重要的调控作用，包括对宿主新陈代谢的调控作用(Darbyetal.,2012)、宿主生殖系统的调控作用(Hurstetal.,1999;刘颖等,2010;Harumoto and Lemaitre,2018)等。

相比于胞外共生菌，胞内共生菌的种类要少得多。胞内共生菌位于宿主细胞内，主要通过母系细胞质进行垂直传播，且多数无法离体培养，这些特性使得对胞内共生菌的研究工作更具难度。但正是由于母系垂直传播的特性，某些共生菌在进化过程中为了扩大自身在宿主种群中的传播，对宿主的生殖系统产生了调控作用，一种较为显著的现象就是使宿主种群的性别比率发生明显变化(Engelstädter and Hurst,2009)。近年来，研究人员们发现多种内共生菌对宿主的调控作用是多方面的，包括调控宿主的行为(Dionetal.,2011)、免疫(Grossetal.,2009;Nyholm and Graf,2012)、新陈代谢(McCutcheonetal.,2009)、进化(Brucker and Bordenstein,2012) 等。沃尔巴克氏体Wolbachia作为一种兼性内共生菌，因其分布广泛、对宿主具有多种调控作用，成为研究最广泛的内共生菌之一。

Wolbachia最初被发现于尖音库蚊Culexpipiens的生殖组织中 (Hertig and Wolbach,1924)，属立克次氏体目α-变形菌门，革兰氏阴性菌。随后通过抗生素消除处理证实宿主的胞质不亲和现象和该菌有关(Yen and Barr,1971)，接着陆续发现Wolbachia具有杀雄、雌性化、孤雌生殖等其他生殖调控作用，使其逐渐成为研究热点。Wolbachia存在于许多节肢动物尤其是昆虫中，包括库蚊Culex(Hertig and Wolbach,1924;宋社吾等,2002)、伊蚊Aedes(Trpisetal.,1981)、果蝇Drosophila(Klassonetal.,2009;熊恩娟等,2014)、寄生蜂(刘宏岳等,2009;Monninetal.,2017)、小菜蛾Pletellaxylostella(Delgado and Cook,2009)、褐飞虱Nilaparvatalugens(屈吕宇等,2013)等，其中有多种昆虫属于农业害虫及疾病媒介昆虫。Wolbachia在昆虫中的广泛分布及其对宿主的调控作用被认为具有良好的生物防治应用前景。

迄今为止该内共生菌已有近百年的研究历史，在Web of Science上以“Wolbachia”为关键词搜索可以发现1950年后的相关研究报道已经超过5 300篇；特别是进入21世纪后的研究工作突飞猛进，相关研究报道超过5 000篇，涉及生化与分子生物学、基因遗传学、进化生物学以及寄生生物学等多个方面。在该共生菌被发现及命名后，其研究工作迅速发展，尤其是其对不同宿主物种的生殖调控作用及通过对该菌的某种调控方式可达到对某些疾病媒介宿主物种的防控从而减少某些疾病的传播，受到更多的研究人员重视并开展相关的研究工作。

本文主要对近年来节肢动物内共生细菌Wolbachia与宿主间相互作用关系的研究进展做一个回顾和综述，重点是阐述Wolbachia对宿主的调控作用及调控方式，Wolbachia基因组相关研究进展及在生物防治的应用研究进展，并对未来的研究方向提出展望。

1 Wolbachia对宿主的感染

Wolbachia是一种在节肢动物中普遍存在的内共生菌。据推测，有40%～60%的节肢动物都感染有Wolbachia(Hilgenboeckeretal.,2008;Zug and Hammerstein,2012)。目前有大量不同宿主中Wolbachia感染情况检测及系统发育分析的相关研究报道：Ahmad等(2017)在白纹伊蚊Aedesalbopictus中检测到的感染率为雄虫98.6%，雌虫95.1%；娄恒等(2015)在不同地理种群的花蓟马Frankliniellaintonsa中检测到的感染率为0～60%；李绍建等(2019)在不同地理种群的棉蚜Aphisgossypii中检测到的感染率为6.67%～46.67%。但其对Wolbachia感染率的检测数据都远远低估了其在自然界中的感染率。主要原因如下：(1)有的物种感染有Wolbachia，但由于感染率较低、取样量有限，存在样本中未检测到Wolbachia感染但自然种群中存在Wolbachia的情况；(2)目前检测Wolbachia感染的方法主要是通过PCR扩增Wolbachia的细菌表面蛋白基因wsp(Zhouetal.,1998)，而在PCR扩增过程中可能会因操作不当等主观原因存在假阴性现象。

采用多位点序列分型分析(multilocus sequence typing,MLST)的方法，构建不同株系间的系统发育关系，可以把Wolbachia分为多个超群(supergroup)(Baldoetal.,2006)，目前研究报道最多的是A～D超群。不同的昆虫物种与不同的Wolbachia超群间可能存在某种特殊的“适应性”，如A,B,E,G,H,I,K,M,N,O,P和Q超群感染的宿主都是节肢动物(Lefoulonetal.,2016)；C和D超群感染的宿主是线虫(Darbyetal.,2012;Lefoulonetal.,2016)；F超群感染的宿主既有线虫也有节肢动物(Lefoulonetal.,2016)；鳞翅目昆虫感染的Wolbachia多属于A超群和B超群，而且大多都属于B超群(Tagami and Miura,2004;Ahmedetal.,2016)。

2 Wolbachia对宿主的调控作用

2.1 生殖调控

Wolbachia对宿主的调控作用一直是Wolbachia相关研究中的热点，而且由于它在生物防治方面的应用前景，受到研究人员的高度关注(表1)。目前已有记载的Wolbachia对宿主的生殖调控方式主要有4种，分别是胞质不亲和、杀雄、雌性化及孤雌生殖(图1:A)。

2.1.1胞质不亲和：胞质不亲和，即感染雄性个体与未感染雌性个体之间交配后产的卵无法发育为正常个体。胞质不亲和又分为单向不亲和与双向不亲和两种形式。单向不亲和是指感染雄性个体与未感染雌性个体间交配不亲和，但感染雌性个体与未感染雄性个体间交配则是亲和的；双向不亲和是指感染不同互相不亲和Wolbachia株系时，感染雄性个体与未感染雌性个体间及感染雌性个体与未感染雄性个体间的交配都是不亲和的。

胞质不亲和是Wolbachia在节肢动物中记载最多的一种生殖调控方式(Werrenetal.,2008)。虽然胞质不亲和的分子机制目前仍不清楚，但细胞学的相关研究显示，被感染后父系染色体凝集异常且在第一次有丝分裂时期异常分离，导致胚胎死亡(Serbusetal.,2008)。在一些昆虫宿主中(Dobsonetal.,2001;Riegler and Stauffer,2002;Merçot and Charlat,2004)，胞质不亲和可用“修饰-营救”(modification-rescue)模型解释：Wolbachia修饰(modification)感染雄性个体的精子使其丧失生殖功能，且这种修饰作用只有在与感染同种Wolbachia的雌性个体卵子融合时才可以被营救(rescue)(Werren,1997;Charlatetal.,2001)。

LePage等(2017)假设Wolbachia的基因组中存在与其胞质不亲和作用有关的功能基因，并通过比较基因组学等方法鉴定出了果蝇中Wolbachia的数个噬菌体WO基因与其胞质不亲和作用有关；Zheng等(2019)结合昆虫不育技术通过田间试验证实了Wolbachia胞质不亲和作用可以成功应用于生物防治。

2.1.2杀雄：杀雄，即宿主感染Wolbachia雌性个体的雄性后代被杀死在发育早期(通常发生在卵期，也可以发生在1龄幼虫期)，从而出现明显偏向于雌性的性比失衡现象。

Hurst等(1999)发现二星瓢虫Adaliabipunctata和非洲珍蝶Acraeaencedon中存在具杀雄作用的Wolbachia株系，可以将雄性宿主个体杀死于胚胎发育时期；随后在甲虫Triboliummadens(Fialho and Stevens,2000)、幻紫斑蛱蝶Hypolimnasbolina(Dysonetal.,2002)、果蝇Drosophilainnubila(Dysonetal.,2002;Dyer and Jaenike,2004)等物种中陆续发现具有杀雄作用的Wolbachia株系。

有学者对杀雄作用提出以下假说：Wolbachia可使其感染雌性个体从未感染雄性个体的死亡中获得某种“好处”：这种“好处”可能是近亲繁殖的减少或资源竞争力的下降(Hurst and Majerus,1993)，Elnagdy等(2011)在瓢虫中的相关研究结果符合该种假说。Riparbelli等(2012)发现，在果蝇中Wolbachia的杀雄作用跟染色质异常重排有关；Harumoto等(2018)发现，在果蝇中杀雄Wolbachia会导致DNA损伤及雄性胚胎形成时期的不正常细胞死亡，这跟果蝇中另一具杀雄作用的共生菌Spiroplasma的杀雄作用极为相似，不同的是未发现Wolbachia对雄性胚胎的神经发育有明显影响。

Wolbachia杀雄作用的分子机制尚不清楚。由于杀雄作用跟多种因素相关，且Wolbachia不是具有杀雄作用的唯一共生物，其他共生物如Spiroplasma(Harumoto and Lemaitre,2018) 等也具有杀雄作用，这使得对该种生殖调控方式的研究更具挑战性。

2.1.3雌性化：雌性化是指基因型为雄性表型却为雌性的一种现象，它是Wolbachia对宿主生殖系统调控的另一种方式。Wolbachia调控的雌性化最典型例子发现于甲壳纲等足目鼠妇Armadillidiumvulgare(Juchaultetal.,1992;Cordauxetal.,2004)，在雌性为异性配子的叶蝉(Negrietal.,2006)和鳞翅目昆虫中也有相关研究报道。

雌性化的具体机制目前尚不清楚。鳞翅目昆虫性别决定机制较为特殊，雌性为异性配子，在鳞翅目中Wolbachia诱导产生的雌性化应是基因型雄性(ZZ)表型雌性的个体。Wolbachia在鳞翅目昆虫中的雌性化最早发现于Euremamandarina(Hirokietal.,2002)；Narita等(2007)通过对不同龄期的E.mandarina幼虫喂食抗生素，发现经抗生素喂食后发育的成虫在翅、生殖系统及生殖器上表现出明显的中性特征，且这些中性特征在1龄幼虫期喂食处理后发育的成虫上最为显著；但E.mandarina中的雌性化似乎比预期中的情况更为复杂，感染雌性化wFem株系Wolbachia的雌性个体只有1条Z染色体，并不是假想中的ZZ型雌性个体(Kernetal.,2015)；随后的研究证实wFem株系Wolbachia可以扰乱感染雌性个体中Z染色体的遗传(Kageyamaetal.,2017)。

2.1.4孤雌生殖：与胞质不亲和类似，Wolbachia引起的孤雌生殖会扰乱早期胚胎发育时期的正常细胞周期(Werrenetal.,2008)。诱导孤雌生殖的Wolbachia株系主要被发现于膜翅目，在螨类及缨翅目中也有记载(Arakakietal.,2001;Weeks and Breeuwer,2001)。孤雌生殖可分为产雄孤雌生殖和产雌孤雌生殖，而Wolbachia被认为是引起产雌孤雌生殖的常见微生物之一。

孤雌生殖Wolbachia株系在超群A和B中都有研究报道，这些株系的作用机制不尽相同(Stouthameretal.,1993)。在赤眼蜂Trichogramma和Leptopilinaclavipes中，细胞学研究表明其孤雌生殖是由于第一次胚胎细胞分裂时期的染色体不正常分离(Stouthamer and Kazmer,1994;Pannebakkeretal.,2004)；Gottlieb等(2002)比较了产雌孤雌生殖物种Muscidifuraxuniraptor的早期胚胎发育时期与其联系较为紧密的产雄物种Muscidifuraxraptorellus的未受精的卵发育时期，发现M.uniraptor中的二倍体恢复时期与之前描述的Wolbachia产雌孤雌生殖的时期不同；另一较为特别的孤雌生殖机制发现于一种植食螨类Bryobia中，抗生素处理显示苜蓿苔螨Bryobiapraetiosa及另一未鉴别物种中，孤雌生殖直接与Wolbachia感染相关，微卫星位点显示该孤雌生殖是功能性的单性生殖而不是配子复制(Weeks and Breeuwer,2001)。

在目前已有的研究报道中，Wolbachia引起的孤雌生殖都与单倍二倍体性别决定机制有关，即单倍体卵发育为雄性，双倍体卵发育为雌性的特殊性别决定机制。大体而言，孤雌生殖Wolbachia株系可引起未受精的单倍体卵形成双倍体卵，并发育成雌性子代。

2.2 其他调控方式

除了Wolbachia的4种常见生殖调控方式外，另有相关研究报道了不同Wolbachia株系的一些其他调控方式。例如调控宿主新陈代谢、抵制病原菌、影响宿主行为及生殖力等(图1:B)。

Wolbachia是一种兼性内共生菌，在一些节肢动物物种中可为其宿主提供生长发育、繁殖所必需的营养物质。如在温带臭虫Cimexlectularius中，Wolbachia可为其宿主提供B族维生素(Nikohetal.,2014)；在灰飞虱Laodelphaxstriatellus和褐飞虱N.lugens中，Wolbachia可为其宿主补充B族维生素(Juetal.,2019)。

Hedges等(2008)发现Wolbachia感染有利于提高果蝇的免疫力，影响病毒感染。随后有研究报道Wolbachia感染能帮助宿主抵抗RNA病毒，提高果蝇对病毒的抗性(Teixeiraetal.,2008;Osborneetal.,2009;Martinezetal.,2014)。有研究人员先后将wAlbB,wMelPop及wMel株系Wolbachia转染入埃及伊蚊Adesaegypti中；相关研究显示，转染Wolbachia后的埃及伊蚊传播登革热病毒的能力显著下降(Xietal.,2005;McMenimanetal.,2009;Moreiraetal.,2009;Walkeretal.,2011)。随后，研究人员将转染了相关株系Wolbachia后的埃及伊蚊在野外释放观察其生防效果，wMelPop株系因其对宿主寿命及生殖力方面的影响被认为不适合于野外释放，Hoffmann等(2011)证实wMel株系在野外释放可以抑制登革热病毒在埃及伊蚊中的传播。

也有研究报道Wolbachia可影响宿主的行为及繁殖力。Vavre等(1999)发现赤眼蜂Trichogrammabourarachae中Wolbachia的存在可引起其繁殖力的提高；Fleury等(2000)发现在果蝇寄生蜂Leptopilinaheterotoma中，Wolbachia感染使其繁殖力、成虫存活率及移动能力显著下降；Vala等(2004)发现在二斑叶螨Tetranychusurticae中Wolbachia感染个体相比于未感染个体优先配对。

3 Wolbachia基因组的研究

目前对Wolbachia与其宿主间相互作用的研究，大多数停留在生物学或生理学的水平上，尚缺关于互作机理的深入研究报道。为了深入揭示Wolbachia与其宿主间相互作用的机理，需要借助分子水平和基因水平的研究手段及其相关资料的综合分析。然而由于Wolbachia是胞内共生菌，至今无法离体培养(Mavinguietal.,2005)，如何获得相关株系基因组数据一直是相关研究中的难题。

如何获取足量、纯净的WolbachiaDNA是Wolbachia基因组测序的关键及难点所在。传统的方法是先通过细胞培养获取包含Wolbachia的宿主细胞，再通过一些方法对WolbachiaDNA进行分离及纯化。分离纯化方法包括差速离心、微孔过滤、renografin连续密度梯度离心法、DNase处理、RNase处理等(Sunetal.,2001;Klassonetal.,2009;Iturbe-Ormaetxeetal.,2011)。近年来，随着测序技术及生物信息学的飞速发展，提取宿主整虫DNA用于测序的方法得以实现(Darbyetal.,2012)。

利用Wolbachia作为生防菌对宿主昆虫进行遗传改造，需要对Wolbachia与其宿主相互作用的分子机制开展深入研究(表2)。以果蝇为宿主的wMel株系是首个公布全基因组序列的Wolbachia株系，该基因组大小约为1.27 Mb，最显著的特征是有大量重复序列及可移动元件，这在胞内生活的物种中是较为罕见的(Wuetal.,2004)；以线虫为宿主的wBm株系基因组相比于wMel株系，没有前噬菌体，重复序列也较少(Fosteretal.,2005)；以蚊子为宿主、具胞质不亲和调控作用的wPip株系基因组大小为1.48 Mb，相比于wMel株系和wBm株系具有更多的前噬菌体及ANK(ankyrin repeat encoding)基因，为ANK编码基因及前噬菌体区域的快速进化提供了证据(Klassonetal.,2008)；随后陆续又报道了一些不同宿主及株系的Wolbachia基因组，包括以果蝇为宿主的胞质不亲和wRi株系、wHa株系、wNo株系、wAu株系等。随着基因组的不断公布，促进了Wolbachia基因组及功能基因的研究。

表2 Wolbachia基因组相关研究Table 2 Case studies related to the genomes of Wolbachia

如图2所示，Wolbachia基因组主要包括编码基因、tRNA、rRNA、重复序列及可移动元件(Wuetal.,2004;Fosteretal.,2005;Klassonetal.,2008,2009;Darbyetal.,2012)。WO噬菌体首次报道于2000年，Masui等(2000)通过不同株系的系统发育学研究证明该噬菌体是活跃的，且在不同株系间可以水平传播。LePage等(2017)通过比较基因组学和转基因等手段从果蝇wMel基因组中鉴定出2个与胞质不亲和作用相关的前噬菌体WO基因，cifA和cifB；Perlmutter等(2019)通过比较基因组学、转基因、细胞学研究等手段从果蝇Wolbachia前噬菌体WO中鉴定出一个基因wmk，该基因可以导致早期胚胎的雄性特异性致死及细胞水平上典型的杀雄症状。这些发现引起了研究人员们对Wolbachia基因组中可移动元件的重视，Reveillaud等(2019)首次从以尖音库蚊Culexpipiens为宿主的Wolbachia基因组中鉴定出质粒并命名为pWCP，该质粒为14个基因组成的9.23 kb环状质粒。

图2 Wolbachia基因组结构示意图Fig.2 Schematic diagram of the Wolbachia genome

对于Wolbachia基因组的深入研究，为揭示不同株系Wolbachia系统发育关系(Wuetal.,2004;Brelsfoardetal.,2014)、研究Wolbachia与其宿主间相互作用的分子机制(Darbyetal.,2012;LePageetal.,2017)等奠定了基础。

4 Wolbachia在生物防治中的应用

Wolbachia对宿主的生殖调控作用在很早以前就被认为具有生防应用前景，率先开始生防应用相关研究的是胞质不亲和。早在1967年，就有研究人员试图把Wolbachia应用到害虫的生物防治中。在尖音库蚊的相关研究中，Laven(1967)在笼子中放置比例为1∶1的正常雄性个体与不亲和雄性个体，经过3～4代后可以达到对尖音库蚊的预期防控效果，且在后续小规模田间试验中观察到卵不孵化的比率升高。但在1982年的一项田间试验中，Curtis等通过室内饲养携带胞质不亲和Wolbachia株系的雄性蚊子并释放于野外后并未获得理想的生防效果(Curtisetal.,1982)。Wolbachia胞质不亲和作用的生防应用试验长期不能成功开展的原因主要是：把携带具胞质不亲和作用Wolbachia株系的实验室饲养种群释放到自然种群中，在短时期内确实可以观察到自然种群数量的减少。但由于释放的Wolbachia感染雌性个体是可育的，有替代自然种群的风险，因此很难达到持续、长期的生防效果(Curtisetal.,1982;Dobsonetal.,2002)。同时，释放到野外的携带Wolbachia雄性个体与自然种群中雄性个体间的竞争也是一个备受研究人员关注的问题(Chambersetal.,2011;Zhangetal.,2015,Atyameetal.,2016)。Chambers等(2011)在半野外环境(semi-field conditions)中同时释放野生型蚊子及感染胞质不亲和株系Wolbachia的雄性蚊子，调查携带Wolbachia雄性蚊子的配对竞争力，研究结果表明，在半野外环境中释放感染胞质不亲和株系Wolbachia的雄性蚊子确实会对蚊子种群产生抑制作用。Atyame等(2016)对基于辐射的昆虫不育技术(sterile insect technique,SIT)及基于Wolbachia的昆虫不亲和技术(incompatible insect technique,IIT)进行了比较，其研究结果表明在实验条件下，昆虫不亲和技术相比于昆虫不育技术表现出更高的效率。近期，研究人员结合基于辐射的昆虫不育技术及可产生胞质不亲和作用的Wolbachia株系，通过胚胎注射技术对白纹伊蚊进行改造后，在后续田间试验中发现：持续两年相比于对照点，释放改造后蚊子的试验点野生蚊子的数量锐减率可达90%(Zhengetal.,2019)。这项成功得到了《Nature》杂志的专题报道，同时进一步肯定了Wolbachia的生防前景。

除胞质不亲和外，Wolbachia在果蝇中可提高宿主对RNA病毒抗性的现象也引起了研究人员的关注。埃及伊蚊可携带登革热等虫媒病毒，将自然宿主为果蝇的wMel株系Wolbachia转染入埃及伊蚊后于野外释放可起到抑制登革热病毒传播的作用(Hoffmannetal.,2011)。此外，Wolbachia的其他几种生殖调控作用也被认为具有良好的生物防治应用前景，部分研究人员试图通过对Wolbachia生殖调控作用分子机制的深入研究来寻找关键功能基因，目前在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中已有胞质不亲和及杀雄的相关功能基因被报道(LePageetal.,2017;Perlmutteretal.,2019)，这也为研究人员提供了对于Wolbachia生物防治及遗传改造应用前景的更多思路：Wolbachia的不同生殖调控作用能否更为广泛地应用于更多农业害虫及疾病媒介昆虫的生物防治中？不同的生殖调控作用是否都存在着相关关键功能基因？将已证明在某些宿主种群中生防效果良好的Wolbachia株系转染进其他宿主种群后生防效果如何？随着测序技术、细胞生物学及生物信息学的飞速发展，不同宿主不同株系的Wolbachia基因组不断破译，相信相关机制会逐渐被阐明，相关应用前景会逐渐被拓宽。

5 小结与展望

Wolbachia在一些农业害虫及疾病媒介昆虫物种中广泛分布，且其具有胞质不亲和、杀雄、雌性化及孤雌生殖等生殖调控方式，因而一直被认为具有害虫生物防治和基因工程防治应用前景；同时，Wolbachia对昆虫性别决定机制的影响也一直备受研究人员关注。但是，由于Wolbachia为胞内共生菌、无法离体培养、基因组数据难以获取等原因，Wolbachia与宿主的相互作用机制研究相对较少。目前大量相关研究工作都围绕Wolbachia在不同昆虫物种中的分子检测及系统发育关系分析方面展开(陶云荔等,2015;李菁等,2018)；也有部分研究人员使用抗生素消除的方法研究消除Wolbachia对宿主生殖的影响(李培光等,2015)，这为后续对Wolbachia生殖调控的深入研究提供了基础。近年来，借助于测序技术及生物信息学的飞速发展，使得用宿主整虫测序后分离获得Wolbachia基因组的方法得以实现，这可能会大大加速相关研究的进程；细胞学相关研究方法的进步也使得Wolbachia的细胞培养更具可行性，通过细胞培养获得含有Wolbachia的原代细胞后，有助于后续的研究工作(包括基因组测序等)。

迄今为止，Wolbachia的4种生殖调控方式都有相关的研究报道，也提出了一些相应的理论假说，但很多方面还不够完善。近期有研究人员利用胞质不亲和作用结合昆虫不育技术在田间试验并获得成功，为Wolbachia的生殖调控作用及其可以成功应用于生物防治提供了有利证据。随着Wolbachia基因组、生殖调控作用关键功能基因以及Wolbachia与宿主间作用机制的研究进一步展开，Wolbachia在生物防治及基因工程防治方面的应用将成为未来的主要研究方向。今后，通过寻找Wolbachia生殖调控作用关键功能基因以及阐明Wolbachia与宿主间的作用机制，将会促进农学、医学、遗传学等相关研究领域的快速发展。