超高效液相色谱-串联质谱法同时测定决明子中4种酚酸成分的含量

柏玉冰 李洪 权包敏

[摘要]目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定决明子中绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛4种酚酸的含量。方法 决明子以50%甲醇超声提取;采用Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相系统梯度洗脱，流速为0.5 ml/min，柱温为30℃，进样体积2 μl。采用电喷雾离子源（ESI），进行负离子扫描。结果 绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛浓度分别在0.0200～3.2000、0.0230～3.6800、0.0230～3.6800、0.0280～4.4800 μg/ml内线性关系良好，平均回收率分别为96.8%、99.2%、96.3%、96.9%，所测决明子样品中绿原酸含量为85.691～304.280 μg/g，阿魏酸为5048.3～139 69.0 μg/g，原儿茶酸为1458.2～9919.4 μg/g，原儿茶醛为15.108～22.956 μg/g。结论 本法可用于决明子药材中上述4种酚酸含量的测定，为决明子的抗氧活性量效关系研究奠定基础。

[关键词]超高效液相色谱-串联质谱法;决明子;酚酸;含量测定

[中图分类号] R917          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）8（b）-0004-06

[Abstract] Objective To establish an ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of four phenolic acid components （chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde） in Cassia obtusifolia. Methods Cassia obtusifolia was extracted by ultrasound with 50% methanol. Chromatographic separation was performed on Acclaim 120 C18 （150 mm×4.6 mm， 5 μm） column by gradient elution with the mobile phase consisted of 0.1% formic acid （A） and acetonitrile （B）. The flow rate was 0.5 ml/min， the column temperature was 30℃， and the injection volume was 2 μl. The mass spectra was obtained by electron spray ionization （ESI） under negative ion mode. Results The linear ranges of chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde fell into 0.0200-3.2000， 0.0230-3.6800， 0.0230-3.6800， 0.0280-4.4800 μg/ml， respectively. The average recovery of chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde was 96.8%， 99.2%， 96.3% and 96.9%， respectively. The contents of chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde were 85.691-304.280， 5048.3-139 69.0， 1458.2-9919.4 and 15.108-22.956 μg/g， respectively. Conclusion This method can be used for the determination of four phenolic acids in Cassia obtusifolia， which lays a foundation for the study on the dose-effect relationship of antioxidant activity of Cassia obtusifolia.

[Key words] Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Cassia obtusifolia; Phenolic acids; Content determination

決明子为豆科植物决明（Cassia obtusifolia L.）或小决明（Cassia tora L.）的干燥成熟种子[1]。始载于《神农本草经》，性甘、苦、咸，归肝、肾、大肠经，具有清肝明目、润肠通便的功效[2]。决明子含有蒽醌[3]、萘并吡喃酮[4]、多糖[5]、酚类[6]及多种微量元素[7]等成分，具有保肝[8]、降血脂[9]、降血压[10]、抑菌[11]、抗氧化[12]、泻下[13]等功效。

近年来，为开发其保健功能，关于决明子抗氧化及其产生的保健功能的研究逐渐增多[14-16]。如多糖[17]、挥发性成分[18]、蒽醌类[19]、水提物及醇提物[20]的抗氧化作用，多糖抗氧化作用可清除氧自由基，改善衰老，有抗衰老的保健作用[2]。但不管是抗氧化作用还是进一步的保健作用，其作用强弱均与抗氧化成分在决明子中的含量相关。且有多名学者对这些活性成分进行了含量测定。如：何保江等[18]测定挥发性成分的相对含量为0.63%～13.51%;龙远春等[21]测定总蒽醌的含量为15.64～18.30 mg/g; Guo等[22]测定蒽醌单体的含量为0.40～9.18 mg/g;邓施璐等[23]测定多糖含量为1.93～16.18 mg/g。

而植化成分中，关于抗氧化作用明确的酚酸类[24-25]含量测定的报道罕见，这在一定程度上影响决明子抗氧化量效关系评价。因此，本研究选择酚酸类含绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸和原儿茶醛建立含量测定方法，以期为后期整体评价决明子抗氧活性量效关系提供补充。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品

决明子，采购于各大药材市场，样品信息具体见表1。所有批次药材经株洲市食品药品检验所包敏主管药师鉴定均为豆科植物决明（Cassia obtusifolia L.）的干燥成熟种子。样本存放于株洲市食品药品检验所中药材样品室。所有批次药材均经粉碎后过4号筛，备用。

1.1.2标准品

4種酚酸对照品均购自于中国食品药品检定研究院，分别为绿原酸（纯度99.3%，批号：110753-201716）、阿魏酸（纯度99.0%，批号：110773-201614）、原儿茶酸（纯度99.9%，批号：110809-201205）、原儿茶醛（纯度98.2%，批号：110810-201007）。

1.1.3主要试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，霍尼韦尔有限公司）。

1.1.4主要仪器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）;XSE 205DV电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）;QTRAP 4500三重四极杆质谱（上海爱博才思分析仪器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1色谱-质谱条件

1.2.1.1色谱条件  采用Acclaim 120 C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～6 min，90%A→10%A;6～8 min，10%A;8～8.5 min，10%A→90%A;8.5～10.0 min，90%A），流速为0.2 ml/min，采集时间为10 min，柱温为30℃，进样量2 μl。

1.2.1.2质谱条件  电喷雾电离源（ESI），负离子扫描，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），离子源温度：550℃，电喷雾电压：-4500 V，气帘气：35.0 psi，离子源气1：55 psi，离子源气2：55 psi，碰撞气：氩气。各成分的质谱分析参数具体见表2。

1.2.2溶液的制备

1.2.2.1混合对照品储备溶液  精密称取不同质量的绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛对照品，置25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。经含量折算后，上述各对照品的浓度分别为0.20、0.23、0.23、0.28 mg/ml。

1.2.2.2供试品溶液  取决明子粉末（粉碎后过4号筛），置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液30 ml，称量，超声（100 W，35 kHz）提取50 min，静置至室温，再称量，用50%甲醇溶液补足减失的量，摇匀。提取2次，合并提取液。精密量取1 ml转移至10 ml量瓶内，用50%甲醇溶液稀释至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.3方法学考察

1.2.3.1线性关系考察  精密量取混合对照品精密称取细粉0.5 g储备溶液适量，用甲醇稀释得系列浓度的混合对照品溶液（绿原酸：0.0200、0.0400、0.0800、0.2000、0.4000、0.8000、2.0000、3.200 μg/ml;阿魏酸：0.0230、0.0460、0.0920、0.2300、0.4600、0.920、2.300、3.6800 μg/ml;原儿茶酸：0.0230、0.0460、0.0920、0.2300、0.4600、0.9200、2.300、3.6800 μg/ml;原儿茶醛：0.0280、0.0560、0.1120、0.2800、0.5600、1.1200、2.8000、4.4800 μg/ml），按“1.2.1”项下的条件进行测定，以质量浓度（C）（ng/ml）为横坐标（X），峰面积（A）为纵坐标（Y），计算4个成分的线性回归方程。

1.2.3.2精密度试验  取混合对照品溶液，按照“1.2.1”项下条件连续进样6次，记录各成分峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。

1.2.3.3重复性试验  取同一批样品（1号样品，河北安国，20190607），称取6份，按照“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”项下条件进样分析，记录各成分峰面积并计算RSD。

1.2.3.4稳定性试验  取同一批样品供试品溶液（1号样品，河北安国，20190607），分别于0、2、4、8、12 h，按照“1.2.1”项下条件进样分析，记录各成分峰面积并计算RSD。

1.2.3.5加样回收试验  取已知含量的样品（1号样品，河北安国，20190607）6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入绝对含量接近0.25 g药材所含量的对照品溶液后，按“1.2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液，按照“1.2.1”项下条件进样分析，计算加样回收率。

1.2.4供试液制备条件优化

1.2.4.1最佳提取溶剂考察  比较不同的提取溶剂，包括水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、100%甲醇。以4种成分的含量大小为判断依据，确定最佳提取溶剂。

1.2.4.2最佳提取时间考察  比较不同的提取时间，包括10、20、30、40、50和60 min，以4种成分的含量不再增加为判断依据，确定最佳提取时间。

1.2.4.3最佳提取体积考察  比较不同的提取体积，包括10、20、30、40、50 ml，以4种成分的绝对含量最大为判断依据，确定最佳提取体积。

1.2.4.4最佳提取次数考察  比较不同的提取次数，包括1、2、3、4、5次，以每种酚酸成分经最佳次数提取后的含量占5次提取后含量的95%以上且不再显著增加为判断依据，确定最佳提取次数。

1.2.5色谱条件优化

1.2.5.1色谱柱的比较  比较三款不同的色谱柱，包括Agela Venusil AS-TC18、Welch Xtimate C18、Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），以4种成分的分子离子峰的保留性和峰型为判断依据，确定最佳色谱柱。

1.2.5.2流动相的比较  比较两种不同的流动相系统，包括乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-含5 mmol/L的乙酸铵0.1%甲酸水，以4种成分的峰面积大小为判断依据，确定最佳提取溶剂。

1.2.5.3不同流速和进样体积的比较  比较不同的流速，包括0.4、0.5、0.6 ml/min，以4种成分的峰型为判断依据，确定最佳流速。同样的条件下考察比较了不同的进样体积，包括1、2、3 μl，以4种成分的峰型为判断依据，确定最佳进样体积。

1.2.6样品测定

精密称取6批次不同批号的决明子各2份，分别按照“1.2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”项下条件进样测定，带入线性回归方程计算4个成分含量。

2结果

2.1方法学考察

2.1.1线性关系考察

按照线性关系试验方法进行实验，结果显示，4种成分在各自线性范围内呈良好的线性关系，具体见表3。

2.1.2精密度试验

按照精密度试验方法进行实验，结果显示，绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛峰面积的RSD分别为0.71%、0.64%、0.87%、0.92%，提示精密度良好。

2.1.3重复性试验

按照重复性试验方法进行实验，结果显示，绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛峰面积的RSD分别为1.44%、1.53%、1.25%、1.88%，提示该方法重复性良好。

2.1.4稳定性试验

按照稳定性试验方法进行实验，结果显示，各成分峰面积的RSD分别为2.34%、2.35%、1.76%、2.23%，提示供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.1.5加样回收试验

按照回收率试验方法进行实验，结果如表4所示，绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、原儿茶醛的平均回收率为96.8%、99.2%、96.3%、96.9%，RSD分别为2.66%、3.38%、2.34%、3.09%，提示本方法回收率良好。

2.2供试液制备条件优化

2.2.1最佳提取溶剂考察

最佳提取溶剂考察结果具体见图1和表5，结果显示，当甲醇浓度为50%时，4种酚酸成分的含量均最大，因此选择50%甲醇为最佳提取溶剂。

2.2.2最佳提取时间考察

最佳提取时间考察结果具体见图2和表6，结果显示，4种成分均在提取50 min时达到最大值。而当提取时间超过50 min时，含量不增反降，尤其是原儿茶酸，这可能是由于随着超声的时间增加，水温升高，促使部分酚酸被空气中的氧气氧化，因此最佳提取时间为50 min。

2.2.3最佳提取体积考察

最佳提取体积考察结果具体见图3和表7，结果显示，当提取体积为30 ml时，其含量的绝对值已经达到上限，因此最佳提取体积为30 ml。

2.2.4最佳提取次数考察

最佳提取次数考察结果具体见图4和表8，结果显示，当第2次提取时，其4种成分的含量已经占5次含量之和的95%以上，因此最佳提取次数为2次。

2.3色谱条件优化

2.3.1色谱柱的比较

色谱柱比较结果显示，当使用Agela Venusil AS-TC18色谱柱时，出峰时间较快，4个成分均在3 min以内全部出峰，但是4个成分均有拖尾现象;当使用Welch Xtimate C18和Acclaim 120 C18色谱柱色谱柱时，4种化合物出峰时间相当，均为5～7 min;但是当使用Welch Xtimate C18时，4个成分均有拖尾现象;而当使用Acclaim 120 C18色谱柱，出峰时间为5～7 min，峰型均较好，因此选择Acclaim 120 C18色谱柱较为合适。

2.3.2流动相的比较

流动相比较结果显示，随着乙酸铵的加入，4种成分的峰面积均减小，提示乙酸铵对酚酸类成分的离子化具有抑制作用。

2.3.3不同流速和进样体积的比较

不同流速比较结果显示，不同流速情况下出峰时间相差不大，而且峰型均较好，因此推测小范围内不同流速对于峰型并无明显影响。和不同流速情况类似，不同流速对于峰型无明显影响。因此，选择流速0.5 ml/min和进样体积2 μl为本次实验的条件。

2.4样品测试

基于上述优化后的提取工艺和检测条件，对收集的10批样品进行测定，结果如表10所示。

3讨论

根据供试液制备条件优化，研究确定了供试液的最佳制备条件：提取溶剂为50%甲醇，提取时间为50 min，提取体积为30 ml，提取次数为2次;根据色谱条件的优化，研究确定了较为合适的色谱条件：色谱柱为Acclaim 120 C18色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水，流速为0.5 ml/min，进样体积为2 μl。联合仪器自动优化得出的最佳质谱条件，本研究建立了决明子中绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸和原儿茶醛4种酚酸成分的超高效液相-串聯质谱含量测定方法。本方法的完成，可同时简单、快速和高效地得出决明子中多种酚酸成分的含量，为决明子酚酸抗氧化的量效关系、质量控制等进一步的研究奠定了基础。