超高效液相色谱三重四极杆/复合线性离子阱质谱测定水样中三苯甲烷类及代谢物

2014-12-16周岩赵永刚张蓓蓓章勇陈国松��

分析化学 2014年3期

周岩+赵永刚+张蓓蓓+章勇+陈国松��

摘要建立了固相萃取（SPE）/超高效液相色谱三重四极杆/复合线性离子阱质谱（UPLC MS/MS/MS）同时测定水体中孔雀石绿（MG）、结晶紫（CV）、亮绿（BG）及其代谢产物隐性孔雀石绿（LMG）和隐性结晶紫（LCV）5种三苯甲烷类残留的方法。100 mL水样过滤后用对甲苯磺酸溶液调节pH=4，经MCX阳离子固相萃取柱富集净化后，采用BEH C18色谱柱，以乙腈 5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.02%甲酸）作为流动相进行梯度洗脱，采用“杆阱扫描”（MRM IDA EPI）正离子模式进行检测。5种三苯甲烷类物质MG， LCV， BG， LMG和CV在0.02～10 μg/L浓度范围内线性良好（r>0.998），回收率为70.9%～101%，相对标准偏差（RSD，n=6）为3.4%～11.9%，方法检出限为0.42～2.2 ng/L，定量限为1.7～8.7 ng/L。本方法快速、灵敏，适用于水体中5种三苯甲烷类残留物的痕量测定。

关键词三苯甲烷类；超高效液相色谱；三重四极杆/复合线性离子阱质谱；固相萃取；水样

1 引言

孔雀石绿（Malachite green，MG）、结晶紫（Crystal violet，CV）和亮绿（Brilliant green，BG）均为三苯甲烷类染料，因其具有消毒杀菌作用而广泛用于水产养殖中。 MG和CV在生物体内分别代谢降解产物为隐性孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG）和隐性结晶紫（Leucocrystal violet，LCV）。三苯甲烷类及其代谢物具有较高毒性、致癌、致畸、致突变等特性，在生物体内具有较高残留，对人体危害较大，近年成为水体污染和水产品安全的重点监控污染物[1～3]。美国、加拿大和欧盟等国已将MG、CV列为水产养殖禁用药，许多国家也制定了相关的法律法规及检测措施，爱尔兰规定养殖排放水中MG含量不得超过100 μg/L，饮用水中不得超过1.0 μg/L[4，5]。我国于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物中；农业行业标准使用准则《无公害食品渔用药物使用准则》（NY 5071 2002）中也将MG列为禁用药物；同时严禁在水产养殖中使用MG和CV，并规定MG（含LMG）和（含LCV）不得检出。但由于MG抗菌性效果好，价格低廉，替代品少等原因，仍有少部分养殖用户违法使用。关于水产品中的三苯甲烷类物质及其代谢物的检测方法已经建立了相应的国标、行标[6～8]，但目前对水环境中这类杀菌剂并没有相关控制限值，存在环境监管盲点，安全隐患较大。三苯甲烷类物质分子式见图1。

目前，三苯甲烷类物质的测定多采用液相色谱法（紫外检测、荧光检测）或液相色谱质谱联用技术。由于LMG和LCV在紫外可见区无吸收峰，而MG和CV又无荧光响应，故采用高效液相法同时测定这几类物质时常需要借助一定的前处理手段，过程繁琐且方法检出限较高（一般为μg/L级）[9～12]。而采用质谱法[13～16]检测相对于液相色谱法而言具有更高的灵敏度和更强定性能力。

目前，对三苯甲烷类的残留检测文献多集中在水产品中的研究，而针对水环境中这类物质的研究很少，并且目标化合物的种类也很少[2，11，12，17]，国家尚无相关控制标准。本实验采用的超高效液相色谱复合质谱是一种先进的新型质谱仪器，串联四极杆线性离子阱技术，与普通的液相色谱三重四极杆串联相比极大提高了MS/MS扫描能力，缩短分析时间，建立一种简单、快速、灵敏的方法同时测定水体中5种三苯甲烷类物质，为进一步分析评价生态环境中污染情况提供可靠的检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

超高效液相色谱ACQUITY UPLC（美国Waters公司）；AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪（美国 AB公司）；固相萃取仪（美国 Supelco公司）；固相萃取柱Oasis MCX 150 mg/6 mL（美国 Waters公司），氮吹浓缩仪（美国 Zymark公司）； 0.22 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜针头式过滤器（美国 Millipore公司）；Milli Q超纯水器（美国 Millipore公司）；涡旋混合器（日本 LMS公司）。

标准品孔雀石绿（MG，纯度98.0%）、隐性孔雀石（LMG，纯度97.0%）、结晶紫（CV，纯度92.5%）、隐性结晶紫（LCV，纯度99.0%）、亮绿（BG，纯度96.0%）、氘代隐性孔雀石（LMG D6，纯度98.5%）、氘代结晶紫（CV D6，纯度99.0%）均为德国Dr. Ehrenstorfer公司试剂；氘代孔雀石绿（MG D5，纯度99.7%）和氘代隐性结晶紫（LCV D6，纯度99.8%）为德国Witega公司试剂。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、异丙醇、乙酸铵（色谱纯，德国 Merck试剂）；盐酸羟胺、对甲苯磺酸（纯度99%，瑞士 Adamas公司）；实验用水Millipore超纯水（电阻率：18.2 MΩ cm）。

2.2 溶液配制

1000 mg/L标准储备液：准确称取（10±0.1） mg的MG， LMG， CV， LCV和BG标准品及MG D5， LMG D6， CV D6和LCV D6内标物，用乙腈分别溶解于10 mL容量瓶中，配制1000 mg/L的储备液。以上标准溶液避光于4 ℃保存，临用前稀释成适当浓度的标准工作溶液。

配置成MG D5 ， LMG D6， CV D6和LCV D6的浓度均为100 μg/L的乙腈溶剂，待用。

2.3 色谱条件

ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱（50 mm ×2.1 mm， 1.7 μm，美国Waters公司）。流动相： 5 mmol/L乙酸铵溶液（0.02%甲酸）（A）和乙腈（B）；采用梯度洗脱模式：0～0.5 min，20% B；保持；0.5～3.0 min，20%～80% B； 3.0～4.0 min， 80% B；4.0～5.0 min， 20% B。流速0.5 mL/min，进样体积5 μL；样品室温度8 ℃；柱温：50 ℃；内标法定量。

2.4 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描方式，“杆阱扫描”（MRM IDA EPI）方式。离子化电压（IS）：5000 V，离子源温度（TEM）：600 ℃，气帘气（CUR）： 276 kPa（40 psi），喷雾气（GS1）：379 kPa（55 psi），辅助加热气（GS2）： 413 kPa （60 psi），碰撞器（CAD）：High。各物质离子对优化后参数见表1。

2.5 样品处理

分别用5 mL乙腈、5 mL 5%甲酸溶液活化MCX固相萃取柱。量取100 mL水样，加入2 mL 10%盐酸羟胺溶液防止待测物降解、1 mL 1.0 mol/L对甲苯磺酸溶液（酸化水样，并有利于形成离子对[16]）。摇匀后，以约1 mL/min流速将水样通过小柱，以富集水样中的三苯甲烷类化合物。上样后，依次用3 mL丙酮、5 mL乙腈、5 mL水淋洗小柱除杂，用氮气吹扫小柱20 min，去除小柱中的水分。最后用10 mL氨水乙腈（5∶95，V/V）溶液洗脱，收集洗脱液。将洗脱液置于氮吹管中，用氮吹浓缩仪吹至尽干，用乙腈定容至1.0 mL，加入10 μL 100 μg/L内标混合溶液，涡旋振荡混匀，过0.22 μm PVDF滤膜，置于进样瓶中，待测。3 结果与讨论

3.1 质谱条件选择

采用“杆阱扫描”（MRM IDA EPI）模式，选择＼[M+H]+为母离子，再以适当的碰撞能量对MG， LMG， CV， LCV和 BG及其对应同位素内标物进行二级质谱扫描，以响应相对较强的子离子作为定量离子。详细参数见表1。

三重四极杆/复合线性离子阱质谱，既保留串联四极杆较好选择性与灵敏度，也可作为线性离子阱增强二级碎片离子定性功能。“杆阱扫描”（MRM IDA EPI）模式，一次进样可得到用于定量的MRM色谱图及用于定性的二级质谱图，与常见的三重四极杆扫描模式相比，增强了二级碎片子离子扫描，极大提高了MS/MS的扫描能力，更有利于增强复杂介质中微量目标化合物的定性能力。图2以MG为例，比较了EPI扫描模式与MS/MS子离子扫描模式对比， 10 μg/L MG在EPI扫描模式下，碎片离子响应增强近100倍。以MG物质为例，定量离子m/z313.1在MRM分析时进一步得到的子离子扫描的谱图，如图3所示。

由于三苯甲烷类化合物属于极性分子，选用ESI离子源相比于APCI离子源，离子化效率更高。MG， CV和 BG具有铵离子基团，LMG， LCV具有二甲胺基，因此离子化采用正离子ESI源。三苯甲烷类物质二级碎片质谱图见图4。

3.2 色谱条件流动相选择

目标化合物三苯甲烷类物质属于弱碱性物质，在超高效液相色谱质谱联用中，对于正离子电喷雾扫描模式，流动相在弱酸性环境条件下加入适量乙酸铵可以提高待测物离子化效率[18]。当水相中同时添加乙酸铵和甲酸时，有利于目标分析物的分子离子化，目标化合物的色谱峰峰形得到极大改善。本实验考察了流动相乙腈 5 mmol/L乙酸铵（分别含0.01%，0.02%，0.05%，0.10%和0.20%甲酸）对流动相对目标化合物的影响。随着H+浓度增加，其对目标分析物的质子化作用增强，分析物在流动相中的电离相应增加，保留能力降低，同时峰形展宽，响应下降。pH值越低，尤其对LCV的峰形影响越大、色谱峰响应减弱、峰形变宽拖尾（图5中列出流动相不同浓度甲酸对LCV物质的影响）。当甲酸的浓度低于0.02%时，对峰形无影响。根据峰形、响应强度、分离度等因素综合考虑，图5 LCV在不同甲酸浓度下的色谱图

3.3 内标物的选择

实验表明，三苯甲烷类物质对内标物的要求非常严格，由于三苯甲烷类物质本身的不稳定及源内裂解等一些特性，选用不同的内标，对各目标物标准曲线的线性影响显著。在相同的线性范围下，选择不同内标物所获得的线性相关系数见表2。结果表明，选择与自身结构及性质尽可能相似的内标，可以很好地校正因不稳定和源内裂解产生的误差问题。内标物的影响在文献＼[13]中也有提及。

3.4 固相萃取前处理的条件优化

3.4.1 固相萃取柱的选择比较了C18、HLB柱和MCX柱对三苯甲烷类物质的萃取效率，结果表明，MCX对三苯甲烷类物质有较好的萃取率，而采用C18、HLB柱进行萃取时，5种物质的回收率较低（10%～50%）。由于MG， CV， BG属于碱性离子型化合物，LMG和LCV在酸性溶液中也是离子型化合物，阳离子交换柱适合碱性离子型化合物的富集与分离，这与实验结果相吻合。

3.4.2 固相萃取柱的活化溶剂的选择三苯甲烷类物质在酸性条件下易形成阳离子。根据阳离子固相萃取柱上样条件，样品溶液pH值要小于其pKa两个单位，保证上样溶液带正电荷[2]。

本实验分别用乙腈、水和乙腈、甲酸水活化固相萃取柱，进行比较。结果表明，如果选用乙腈、纯水活化，对于显性物质MG， CV， BG回收率约为65%，而隐性物质LMG、LCV回收率则低于50%。而固相萃取柱的活化溶液用酸性溶液酸化后，萃取效率明显好转，回收率达到70%以上。所以阳离子交换柱采用酸性溶液活化，上样水样调节为酸性，有利于阳离子交换柱对目标化合物的富集。

三苯甲烷类物质极性较大，水样用离子对试剂对甲苯磺酸酸化，有利于三苯甲烷类物质形成离子对，增加提取效率。同时MG、LMG、CV、LCV、BG对光、热、氧气敏感，易甲基化、氧化，所以，在样品提取时加入还原剂盐酸羟胺[16]，有利于防止待测物的降解。

3.4.3 洗脱溶剂的优化为中和分析物的电荷，阳离子交换柱的洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位，所以洗脱溶剂采用碱性溶液洗脱。在文献＼[15，16]基础上，比较了氨水乙腈（5∶95，V/V）、氨水甲醇（5∶95，V/V）、氨水甲醇乙酸乙酯（5∶45∶50，V/V）3种洗脱液的洗脱效果（见图7）。氨水乙腈（5∶95，V/V）回收率很好；氨水甲醇（5∶95，V/V）对大部分物质回收率低于40%；氨水甲醇乙酸乙酯（5∶45∶50，V/V）对BG损失较大，回收率仅30%。最终洗脱溶剂选择氨水乙腈（5∶95，V/V）。

3.5 方法的分析性能

3.5.1 标准曲线和检出限以各组分的峰面积（y）对浓度（x， μg/L）绘制标准曲线，MG， LCV， BG，LMG和CV线性范围为0.02～10.0 μg/L，质量浓度在线性范围内与峰面积呈良好的线性关系，r>0.998。表3列出三苯甲烷类物质的线性关系及相关系数。

根据国家环境标准[20]空白实验未检出目标物质的检出限测定方法，本实验测定5.0 ng/L 水样，配制7份平行水样，水样体积为100 mL。经全过程分析，计算其浓度的标准偏差s。以3.14 s为检出限（LOD），4倍检出限为定量下限（LOQ），5种物质的检出限为0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有较高的灵敏度，完全满足水体中三苯甲烷类的分析测定。

3.5.2 精密度与回收率方法采用空白水样加标方式，在浓度水平分别为0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加标水样进行回收率测定，每个加标水样平行配制6份样品，其加标回收率及精密度结果见表4。

3.6 实际样品的分析

应用本方法对南京地区、常州地区、苏州地区、无锡地区及太湖流域等不同来源80个点位的地表水、废水环境水样进行分析测定。结果表明，各水域在一定程度上检出，浓度在ng/L水平。其中物质浓度最高的是靠近某化工厂池塘水样MG的浓度为3.64 ng/L，某化工厂长江废水排出口CV的浓度为12.5 ng/L。结果表明，在环境水域中已存在三苯甲烷类物质不同程度的污染。

结果表明，本方法具有操作简便，灵敏度高、准确、重现性好的特点，适合水质监测应用，且杂质干扰少，定性和定量分析更加精确可靠，适合大批量复杂水样的分析。

References

1 Bergwerff A A， Kuiper R V， Scherpenisse P.Aquaculture， 2004， 233： 55-63

2 Srivastava S， Sinha R， Roy D.Aquat Toxicol， 2004， 66（3）： 319-329

3 Bose B， Motiwale L， Rao K V.Cancer Lett.， 2005， 230（2）： 260-270

4 Safarík I， Safariková M.Water Res.， 2002， 36（1）： 196-200

5 Sagar K， Smyth M R， Wilson J G， McLaughlin K.J. Chromatogr. A， 1994， 659（2）： 329-336

6 SC/T 3021 2004，Determination of Malachite Green Residues in Fishery Products. High Performance of Liquid Chromatography.The Aquaculture Industry Standard of the People′s Republic of China

水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法.中华人民共和国水产行业标准.SC/T 3021 2004

7 SN/T 1479 2004，Inspection of Malachite Green Residues in Aquatic Products for Import and Export.The Entry exit Inspection and Quarantine of the Industry Standard of the People′s Republic of China

进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法.中华人民共和国出入境检验检疫行业标准.SN/T 1479 2004

8 GB/T 19857 2005，Determination of Malachite Green and Crystal Violet Residues in Aquatic Product.National Standards of the People′s Republic of China

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定.中华人民共和国国家标准.GB/T 19857-2005

9 ZHANG Zhi Gang， SHI Bing， CHEN Lu Ping， LIN Li Yi， ZHOU Yu.Chinese J. of Anal. Chem.， 2006， 34（5）： 663-667

张志刚，施冰，陈鹭平，林立毅，周昱.分析化学， 2006， 34（5）： 663-667

10 Long C Y， Mai Z B， Zhu B H， Zou X Y， Gao Y H， Huang X D.J. Chromatogr. A.， 2008， 1203（1）： 21-26

11 HONG Bo， YUAN Xi Ping， WAN Ze Wen， LIU Ling Li.Food and machinery， 2012， 28（4）： 84-86

洪波，袁希平，万译文，刘伶俐. 食品与机械， 2012， 28（4）： 84-86

12 Mitrowska K， Posyniak A， Zmudzki J.J. Chromatogr. A.， 2008， 1207（1）： 94-100

13 Hurtaud Pessel D， Coudor P， Verdon E.J. Chromatogr. A.， 2011， 1218（12）： 1632-1645

14 Andersen W C， Turnipseed S B， Karbiwnyk C M， Lee R H， Clark S B， Rowe W D， Madson M R， Miller K E.Anal. Chim. Acta.， 2009， 637（1 2）： 279-289

15 Wu X L， Zhang G， Wu Y N， Hou X L， Yuan Z H.J. Chromatogr. A.， 2007， 1172（2）： 121-126

16 Scherpenisse P， Bergwerff A A.Anal. Chim. Acta.， 2005， 529（1 2）： 173-177

17 Dowling G， Mulder P P， Duffy C， Regan L， Smyth M R.Anal. Chim. Acta.，2007， 586（1 2）： 411-419

18 Tao Y F， Chen D M， Chao X Q， Yu H， Yuanhu P， Liu Z L， Huang L L， Wang Y L， Yuan Z H.Food Control， 2011， 22： 1246-1252

19 MA Rui Xin， SUN Wei Bin， LANG Yu Miao， SHI Jie Qing， GE Mei Li.Hebei Fisheries， 2010， 6： 21-25

马瑞欣，孙伟彬，郎玉苗，石洁卿，葛美丽. 河北渔业， 2010， 6： 21-25

20 HJ 168 2010，Environmental Monitoring Technical Guideline on Drawing and Revising Analytical Method Standards.The National Standard of Environmental Protection of the People′s Republic of China

环境监测分析方法标准制修订技术导则. 中华人民共和国国家环境保护标准.HJ 168 2010