长链非编码RNAROR1-AS1促进骨肉瘤细胞侵袭的机制研究

张勇

[摘要] 目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA） ROR1-AS1对骨肉瘤（OS）侵袭能力的影响。 方法 RT-PCR检测成骨细胞和OS细胞株中lncRNA ROR1-AS1和ROR1的表达;行细胞转染，观察细胞生长情况，再过表达ROR1，Transwell和划痕实验检测细胞侵袭能力;Western-blot检测上皮间质转化相关分子标志物E-caderin、N-caderin、abcam的表达。 结果 与成骨细胞比较，OS细胞中lncRNA ROR1-AS1和ROR1高表达（P < 0.01）;抑制lncRNA ROR1-AS1后，OS细胞中ROR1的mRNA表达下调（P < 0.05）;Transwell和划痕实验显示细胞侵袭能力减弱，过表达ROR1后侵袭能力恢复（P < 0.05）;抑制lncRNA ROR1-AS1后上皮表型标志物E-caderin表达降低，间质表型标志物N-caderin表达增高;过表达ROR1后呈现相反结果。 结论 LncRNA ROR1-AS1促进OS细胞侵袭依赖ROR1。

[关键词] 骨肉瘤;长链非编码RNA ROR1-AS1;ROR1;侵袭;上皮间质转化

[中图分类号] R738.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（a）-0025-04

[Abstract] To investigate the effect of lncRNA ROR1-AS1 on the invasion ability of osteosarcoma （OS）. Methods RT-PCR detected the expression of lncRNA ROR1-AS1 and ROR1 in osteoblasts and OS cell lines; cell growth was observed after cell transfection， ROR1 was overexpressed， and cell invasion ability was detected by Transwell and scratch test. The expression of epithelial to mesenchymal transformation -related molecular markers （E-caderin， N-caderin， abcam） was detected by Western-blot. Results LncRNA ROR1-AS1 and ROR1 were highly expressed in OS cells compared with osteoblasts （P < 0.01）. After lncRNA ROR1-AS1 was inhibited， mRNA expression of ROR1 in OS cells was down-regulated （P < 0.05）. After OS cells knocked down lncRNA ROR1-AS1， Transwell and scratch experiments confirmed that the invasion ability of cells was weakened， while the invasion ability was restored after overexpression of ROR1 （P < 0.05）. After lncRNA ROR1-AS1 inhibition， the expression of epithelial phenotypic marker E-caderin was decreased， while that of mesenchymal phenotypic marker N-caderin was increased. Overexpression of ROR1 presents the opposite effect. Conclusion LncRNA ROR1-AS1 promotes OS cell invasion dependent on ROR1.

[Key words] Osteosarcoma; lncRNA ROR1-AS1; ROR1; Invasive; Epithelial to mesenchymal transformation

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）發病年龄轻，致死率高[1-2]，易转移[3]。手术和化疗虽有一定效果，但死亡率和转移率仍然居高不下[4-5]。因此，阐明OS的侵袭机制，寻找生物标志物，至关重要。非编码RNA在肿瘤的发展中占据重要地位[6]。长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）包含200个以上核苷酸，从表观遗传学、转录和转录后调控等层面参与生物体的调控过程[7-9]，并通过多种机制影响基因和蛋白的表达[10-12]。本研究发现lncRNA ROR1-AS1在OS中过表达，并探讨其在OS细胞侵袭中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人成骨细胞NHOst和人OS细胞株HOS、Saos-2、U20S和MG63（购自ATCC）。胎牛血清（TBD，中国）、DMEM培养基（Gibico，美国），无菌培养箱（Thermo，美国）;lncRNA ROR1-AS1的si-RNA慢病毒、对照病毒、ROR1过表达质粒，定量引物（Genechem，中国）;PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，中国]，SYRB Green染料（Invitrogen，美国，S7563）及逆转录试剂盒（TakaRa，日本，RR037A）。Transwell小室（Corning，美国），稀释基质胶（BD，美国），Lipofectamine 2000 （Invitrogen，美国，11668027），PCR仪（ROCHE，瑞士）;抗体ROR1，E-caderin，N-caderin，抗体（abcam，美国，ab135669、ab76 055、ab18203，1∶400）。

1.2 细胞培养

含10%胎牛血清的DMEM培养基（含青链霉素）培养细胞，克隆至70%～80%更换培养基;培养箱条件：37℃、50 mL/L CO2。

1.3 RT-PCR

检测各细胞株中lncRNA ROR1-AS1的表达。TRIzol法提总RNA，并检测纯度及浓度。依据TaKaRa公司说明书进行逆转录和PCR反应。反应体系20 μL： 2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL;上、下游引物各0.4 μL;cDNA 5 μL;双蒸水4.2 μL。设定程序为两步法RT-PCR：预变性 95℃，1 min;之后每一步变性95℃，5 s;退火延伸 60℃，20 s;共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。lncRNA ROR1-AS1的上游引物序列为5′-CTGACGAAACACTGGAACTC-3′，下游引物序列为5′-GTCTGATTTGGTAGCTTGGATG-3′;ROR1的上游引物序列为5′-CAGATGAGTATGAAGAAGATGG-3′，下游引物序列为5′-ATGGCGAAC-TGAGAACAC-3′;U6作为内参进行相对定量，U6的上游引物序列为5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′，下游引物序列为5′-CACTATTGCGGGCTGC-3′。采用2-△△Ct法计算两者的相对表达量，重复3次。

1.4 细胞转染

依据基因转染操作手册，采用Lipofectamine 2000将过表达和沉默载体（si-lncRNA ROR1-AS1#1，si-lncRNA ROR1-AS1#2）转染进入细胞。经48 h转染后，观察细胞生长情况，收集细胞用于进一步研究。

1.5 Transwell

37℃无菌条件下，50 μg 细胞外基质（ECM）胶加入8 μm孔径的Transwell小室，放置6 h进行包被;ECM胶充分凝固后，于上室加入不含抗生素及血清的培养基，接种细胞2×105个/孔，下室加入含10%血清无抗生素的培养基;24 h后取出小室，无菌棉签擦拭去除上室内的细胞，1%结晶紫染液对小室多孔膜下表面的细胞染色，拍照，计数。染色的细胞穿膜越多，代表侵袭能力越强。

1.6 划痕试验

细胞接种于6孔板，垂直于孔板采用100 μL枪头制作细胞划痕，确保各个划痕宽度基本一致。去除培养液，PBS冲洗孔板，去除细胞碎片。加入不含血清培养基，拍照记录。培养板置入培养箱24 h后，再分别拍照记录，计算划痕距离百分比。

1.7 Western-blot

提取细胞总蛋白，制备8%聚丙烯酰胺凝胶，每孔20 μg上样;80 V积层胶，120 V分离胶进行电泳，100 V转膜90 min，5% BSA封闭PVDF膜1 h，加一抗，4℃振荡过夜。TBST洗涤后滴加二抗，37℃孵育1 h，显影成像。特异性条带净灰度值由Image J软件获取。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA ROR1-AS1和ROR1在人正常成骨细胞和人OS细胞株中的表达情况

2.2 抑制lncRNA ROR1-AS1表达后lncRNA ROR1-AS1和ROR1表达变化

HOS和MG63中转染lncRNA ROR1-AS1的siRNA后，lncRNA ROR1-AS1表达量明显降低（P < 0.05或P < 0.01）;同时，ROR1的表达量也随之下降（P  < 0.05或P < 0.01）。si-lncRNA ROR1-AS1#1具有更好的沉默效能，用于后续实验。见图2。

2.3 lncRNA ROR1-AS1、ROR1對OS细胞侵袭转移能力的影响

2.4 lncRNA ROR1-AS1经由ROR1介导OS细胞上皮间质转化

检测lncRNA ROR1-AS1对上皮间质转化（EMT）的影响，抑制lncRNA ROR1-AS1表达，间质表型标志物N-cadherin表达下降，而上皮表型标志物E-cadherin表达上调;过表达ROR1后，N-cadherin表达上升，而E-cadherin表达下降。见图5。说明lncRNA ROR1-AS1经由ROR1参与OS的EMT。

3 讨论

肿瘤侵袭是造成患者死亡的主要原因[13]。而EMT是肿瘤侵袭中的重要环节，上皮细胞标志物表达下降，间质细胞标志物表达升高，便于肿瘤细胞从原发灶脱离，出现侵袭转移[14]。ROR1的功能在神经系统、循环系统和呼吸系统的中首先发现[15]。ROR1在OS等肿瘤中过表达，同肿瘤病理过程相关[16]。ROR1可以促进EMT和诱导增殖、迁移[17]。Dai等[18]指出ROR1通过非经典wnt信号通路参与OS的侵袭。

LncRNA ROR1-AS1位于人基因组1p31.3，是ROR1基因转录的反义lncRNA。Hu等[19]首次对其功能进行报道：可与EZH2/PRC2结合参与基因转录调控[19]。lncRNA可通过顺式作用调节临近的基因的转录[20]，所以我们推测lncRNA ROR1-AS1可通过调控ROR1参与OS的侵袭。

本研究显示，lncRNA ROR1-AS1在OS中过表达，抑制lncRNA ROR1-AS1表达，ROR1表达量随之下降，OS细胞的侵袭能力下降，EMT的上皮表型标志物表达增高，而间质表型标志物表达降低;在此基础上过表达ROR1，OS细胞的侵袭能力恢复，EMT上皮表型标志物表达下降，间质表型标志物表达升高;提示lncRNA ROR1-AS1对OS细胞的侵袭作用的调控是依赖ROR1的。但其具体分子结合位点及转录调控机制，仍需在后续研究中进一步探讨。

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（收稿日期：2020-02-12）