U18666A对星形胶质瘤U373细胞APP代谢及Aβ生成的影响

杨宏艳 都晓辉 包亚男

[摘要] 目的 观察胆固醇转运抑制剂U18666A（UA）对星形胶质瘤U373细胞淀粉样前体蛋白（APP）代谢及β淀粉样蛋白（Aβ）生成的影响。 方法 0、1、3、5 μg/mL UA 作用U373细胞24 h，或5 μg/mL UA与U373细胞共培养0、12、24、48 h，Western blot检测APP及其代谢产物α-CTF、β-CTF的表达，酶联免疫吸附试验检测细胞内Aβ1-40含量，荧光酶法检测β-分泌酶活性。 结果 3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达水平、β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。共培养24、48 h组APP表达水平、β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于共培养0 h组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。5 μg/mL UA组β-分泌酶活性高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 UA通过增加β-分泌酶活性增强APP的表达和代谢，促进Aβ1-40的生成，加速阿尔茨海默病进程。

[关键词] 胆固醇;U18666A;U373细胞;淀粉样前体蛋白;β淀粉样蛋白

[中图分类号] R749.16          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of cholesterol transport inhibitor U18666A （UA） on amyloid precursor protein （APP） metabolism and β-amyloid protein （Aβ） generation in U373 cells of astroglioma. Methods U373 cells were treated with UA at the dose of zero， one， three and five μg/mL for 24 h or 5 μg/mL UA for different times （0， 12， 24， 48 h）. The expressions of APP and its metabolites α-CTF and β-CTF were detected using Western blot. The cellular levels of Aβ1-40 were measured with enzyme linked immunosorbent assay and the activity of β-secretase was determined by fluorescence assay. Results The expression levels of APP， α-CTF and β-CTF， and Aβ1-40 in 5 μg/mL UA group were higher than those in 0 μg/mL UA group， and the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression levels of APP， α-CTF and β-CTF， and Aβ1-40 in co-cultured 24 h and 48 h groups were significantly higher than those in co-cultured 0 h group， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. The activity of β-secretase in 5 μg/mL UA group was significantly higher than that in the control group （P < 0.01）. Conclusion UA enhances APP expression and metabolism by increasing β-secretase activity， promotes Aβ1-40 generation， accelerates the pathological process of Alzheimer′s disease.

[Key words] Cholesterol; U18666A; U373 cell; Amyloid precursor protein; β-amyloid protein

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，患者脑内有明显的β淀粉样蛋白（Aβ）沉积。Aβ主要由淀粉样前体蛋白（APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶水解产生[1-2]。胆固醇水平偏高患者AD发病风险明显升高[3-6]，胆固醇代谢与AD关系是研究AD发病机制的一个热点。本研究以星形胶质瘤U373细胞为研究对象，加入不同剂量胆固醇转运抑制剂U18666A（UA）作用不同时间，观察UA对U373细胞APP代谢及Aβ生成的影响，为进一步理解胆固醇代谢与AD关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo 3001酶标仪（Thermo）;Power Poc Basic电泳仪（Bio-Rad）;ChemiDoc MP全功能荧光化学发光成像仪（Bio-Rad）;UA[爱必信（上海）生物科技有限公司，MZ28];Y188抗体（Abcam，ab32136）;Aβ1-40试剂盒（Life Technologies，KHB3482）;β-分泌酶活性荧光检测试剂盒（Abcam，ab65357）;β-actin抗体（ZM-0001）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（ZDR-5403）、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（ZB-2305）均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  U373细胞（上海生命科学院细胞资源中心）培养在10% FBS的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。每2～3天换液一次。

1.2.2 分组药物处理  分别加入0、1、3、5 μg/mL UA作用U373细胞24 h或加入5 μg/mL UA作用U373细胞0、12、24 h和48 h。

1.2.3 Western blot测定蛋白表达  实验结束后，收集细胞，按照本研究组前期实验[7]方法提取蛋白。配制10%分离胶和5%浓缩胶，加入等量蛋白样品电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Y188（1∶3000）抗体，4℃孵育过夜。TBST洗3次，二抗（1∶5000）室温孵育1 h，TBST漂洗后显影成像。Quantity-One软件分析蛋白灰度。

1.2.4 酶联免疫吸附试验检测Aβ1-40含量  收集各组细胞样品，RIPA裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集沉淀。按试剂盒说明书操作，检测450 nm各孔光密度值，根据标准曲线计算细胞内Aβ1-40含量。每组2个复孔，实验重复4次。

1.2.5 荧光法检测β-分泌酶活性  5 μg/mL UA作用U373细胞24 h，弃培养基，加入100 μL提取液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清液。按试剂盒说明书依次加入样品、反应液和底物。样品分为对照组、UA组、阴性对照组（加入抑制剂）、空白组（加入培养基）。混匀，37℃避光孵育60 min，激发波长335 nm，发射波长495 nm处检测各孔荧光强度，计算β-分泌酶活性。每组设2个复孔，实验重复4次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UA对U373细胞APP蛋白表达的影响

0、1、3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达量比较，差异有高度统计学意义（F = 20.05，P < 0.01）;3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达水平高于0 μg/mL UA组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。共培养0、12、24 h和48 h组APP蛋白表达量比较，差异有高度统计学意义（F = 19.48，P < 0.01）;共培养24、48 h组APP蛋白表达水平高于共培养0 h组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1。

2.2 UA对U373细胞APP代谢产物β-CTF和α-CTF含量的影响

0、1、3、5 μg/mL UA组β-CTF和α-CTF蛋白表达量比较，差异有高度统计学意义（F = 31.23，P < 0.01;F = 14.35，P < 0.01）;3、5 μg/mL UA组β-CTF和α-CTF蛋白表达量高于0 μg/mL UA组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。共培养0、12、24、48 h组β-CTF和α-CTF蛋白表达量比较，差异有高度统计学意义（F = 28.7，P < 0.01;F = 28.96，P < 0.01）。共培养24 h和48 h组β-CTF和α-CTF蛋白表达量高于共培养0 h组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

2.3 UA对U373细胞Aβ1-40含量的影响

0、1、3、5 μg/mL UA组Aβ1-40含量比较，差异有高度统计学意义（F = 9.181，P < 0.01）。1、3、5 μg/mL UA组Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。共培养0、12、24 h和48 h组Aβ1-40含量比较，差异有高度统计学意义（F = 15.03， P < 0.01）。共培养24、48 h组Aβ1-40含量高于共培养0 h组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

2.4 UA对U373细胞β-分泌酶活性的影响

5 μg/mL UA组β-分泌酶活性高于对照组，差异有高度统计学意义（t = 9.942，P < 0.01）。见图4。

3 讨论

胆固醇是真核细胞细胞膜的重要成分，能够维持膜结构完整性，参与信号转导，促进神经元的发展，维持突触的弹性和功能，在AD的发生发展过程中起重要作用[3，8-12]。高胆固醇饮食可以使AD动物脑内Aβ聚集增多，长期服用大剂量他汀类药物可以改善临床轻中度AD患者的认知功能障碍[9，13]。AD患者及转基因动物脑中可见大量激活的星形胶质细胞，提示星形胶质细胞与AD的发生发展密切相关[14-15]。高水平的膜胆固醇可提高胞浆钙浓度，促进Aβ生成，引起神经细胞死亡[16]。UA可抑制膽固醇的转运，引起胆固醇在细胞内蓄积[17-18]。本研究观察了UA对星形胶质瘤U373细胞APP代谢的调节作用。结果显示，3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达水平高于0 μg/mL UA组;共培养24、48 h组APP蛋白表达水平高于共培养0 h组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。提示UA通过改变胆固醇的水平和分布促进APP的表达，与已有报道相符[19-20]。

Aβ生成过多和细胞外沉积是AD的主要病理特征之一。APP经α-分泌酶水解生成可溶性多肽sAPPα和跨膜片段α-CTF，经β-分泌酶水解生成sAPPβ和跨膜片段β-CTF，β-CTF继续被γ-分泌酶水解生成Aβ1-40或Aβ1-42[2，19]。本研究结果显示，3、5 μg/mL UA组β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA组;共培养24、48 h组β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于共培养0 h组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。β-分泌酶是APP代谢中的关键酶，其含量和活性大小直接决定了Aβ的生成。本研究进一步检测了β-分泌酶的活性，结果显示UA明显增强U373细胞β-分泌酶的活性。

综上所述，胆固醇转运抑制剂UA增加U373细胞APP的表达，促进APP代谢及Aβ生成，其机制与增强β-分泌酶活性有关。

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（收稿日期：2020-03-18）