tPA基因甲基化/去甲基化在丙泊酚保护抑郁大鼠电休克后学习记忆功能中的作用

张帆 朱贤林

[摘要] 目的 探讨丙泊酚改善抑郁大鼠电休克治疗（ECT）后学习记忆功能的组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因甲基化/去甲基化调控机制。 方法 成年雄性SD大鼠72只，随机取18只作为对照组（C组），剩余54只大鼠进行抑郁造模后随机分为D组、E组、F组，每组18只。C组不予实验处理;D组腹腔注射生理盐水+伪ECT;E组腹腔注射生理盐水+ECT;F组腹腔注射丙泊酚+ECT。采用糖水偏好百分比（SPP）、逃避潜伏期（EL）及空间探索时间（SET）检测大鼠抑郁行为及学习功能;逆转录PCR检测海马tPA、DNA甲基转移酶（DNMT）1、DNMT3a、DNMT3b及10～11易位（TET）1mRNA水平;Western blot检测海马tPA及DNMT1的表达;MeDIP-qPCR检测tPA甲基化率。 结果 ECT处理后，与D组比较，E、F组SPP上升，E组EL延长、SET缩短，海马CA1区tPA mRNA及蛋白表达下降，DNMT1 mRNA及蛋白表达增加，tPA甲基化率增加，差异有统计学意义（均P < 0.05）;与E组比较，F组EL缩短、SET延长，海马CA1区tPA mRNA及蛋白表达增加，DNMT1 mRNA及蛋白表达下降，tPA甲基化率降低（均P < 0.05）;各组DNMT3a、DNMT3b及TET1 mRNA的表达差异无统计学意义（均P > 0.05）。 结论 丙泊酚能夠有效减轻ECT诱导的学习记忆损伤，其机制可能与下调海马CA1区DNMT1表达减轻tPA的甲基化水平，增加tPA mRNA及蛋白表达水平有关。

[关键词] 丙泊酚;电休克;组织型纤溶酶原激活物;表观遗传学;学习记忆功能

[中图分类号] R749.054          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（a）-00

11-06

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of Propofol on learning and memory function in depressive rats after electroshock therapy （ECT） by regulating tissue plasminogen activator （tPA） gene methylation/demethylation. Methods Seventy-two adult male SD rats were used in this study and eighteen rats were randomly selected as the control group （group C）. The remaining fifty-four rats were randomly divided into group D， group E and group F after depressive modeling， with 18 rats in each group. Group C was not given experimental treatment; group D was intraperitoneally injected with normal saline + pseudo-ECT; group E was intraperitoneally injected with normal saline + ECT; group F was intraperitoneally injected with Propofol + ECT. Depressive behavior and learning function of rats were measured by sucrose preference percentage （SPP）， escape latency （EL） and space exploration time （SET）. The mRNA levels of hippocampus tPA， DNA methyltransferase （DNMT） 1， DNMT3a， DNMT3b and ten-elevan translocation （TET） 1 were detected by reverse transcription PCR. The expressions of tPA and DNMT1 in hippocampus were detected by Western blot. MeDIP-qPCR was used to detect tPA methylation rate. After ECT treatment， compared with group D， SPP increased in Group E and F， EL prolonged and SET shortened in group E， tPA mRNA and protein expression in hippocampal CA1 area decreased， DNMT1 mRNA and protein expression increased， and tPA methylation rate increased， with statistically significant differences （all P < 0.05）. Compared with group E， in group F， EL shortened and SET prolonged， tPA mRNA and protein expression in hippocampal CA1 area increased， DNMT1 mRNA and protein expression decreased， and tPA methylation rate decreased （all P < 0.05）. There was no significant difference in mRNA expression of DNMT3a， DNMT3b and TET1 in each group （all P > 0.05）. Conclusion Propofol can effectively reduce ECT-induced learning and memory impairment in depressive rats. The mechanism may be related to the downregulate the expression of DNMT1 in the hippocampal CA1 region to reduce the methylation level of the tPA gene resulting in increase the expression level of tPA mRNA and protein.

[Key words] Propofol; Electroshock; Tissue plasminogen activator; Epigenetics; Learning and memory function

电休克治疗（electroconvulsive therapy，ECT）是治疗抑郁症起效最快的方法，但存在学习记忆功能损害等副作用[1-3]。本课题组前期研究[4]发现，丙泊酚麻醉下行ECT可以明显减轻抑郁大鼠的学习记忆功能损害，且与调节海马内组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）相关，然而该研究却未能揭示丙泊酚在此过程中对tPA基因表达的调节机制以及海马CA3及DG区是否也参与其中。研究[5]显示，表观遗传修饰等在基因的转录中发挥了重要的作用，主要包括DNA甲基化/去甲基化等。DNA的甲基化由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化完成，DNA在DNMTs的作用下使其CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC），导致转录活性下降[6]。真核细胞主要表达3类DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b，其中DNMT2作用尚不清楚[7]。研究[8]顯示，5-mC的水平是由DNA甲基化和去甲基化共同决定，DNA中5-mC可在10～11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白家族的羟基化作用下进一步修饰为5-羟甲基胞嘧啶，诱发DNA去甲基化改变，且TET蛋白家族的TET1在脑部的表达水平较高。

本研究拟明确丙泊酚是否可能通过调节海马各分区DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及TET1的表达，进而影响tPA mRNA的水平参与抑郁大鼠ECT后学习记忆功能的变化，以期为临床应用丙泊酚保护抑郁患者ECT后学习记忆功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物选择及建模

2～3月龄健康SD大鼠72只，雄性，SPF级，体重180～250 g。由重庆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2018-0008，实验动物合格证号：0017476。本研究已通过四川省简阳市人民医院科学伦理委员会批准。动物饲养于动物实验研究中心，SPF饲养环境：室温22℃，相对湿度65%，单笼饲养。随机获取54只大鼠采用慢性不可预见性应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立抑郁模型[4]。大鼠每天随机给予1种刺激：明暗颠倒24 h，4℃冰水游泳5 min，45℃热水游泳5 min，禁饮24 h，禁食24 h，夹尾1 min，水平摇晃鼠笼10 min，潮湿垫料24 h，45°鼠笼倾斜24 h。2 d不连续使用同种刺激，连续28 d。CUMS处理后，通过行为学方法评估大鼠抑郁状态，所有大鼠均成功建模。

1.2 动物分组及处理方法

将剩余18只SD大鼠列为对照组（C组）;取建模成功的抑郁大鼠随机分为抑郁组（D组）、ECT组（E组）、ECT+丙泊酚组（F组），每组18只。C组不予实验处理;D组腹腔注射8 mL/kg生理盐水后行伪ECT处理，即两耳夹电极但不予通电;E组腹腔注射生理盐水8 mL/kg后行ECT（Niviqure-SA型，印度Niviqure公司）处理，电极放置方法与伪ECT一致，输出电量约120 mC，以引发大鼠强直—阵挛抽搐作为ECT诱发成功标准[4]。F组腹腔注射丙泊酚注射液80 mg/kg（批号：NG149，意大利AstraZeneca公司）后行ECT处理，方法同E组。实验处理1次/d，连续7 d。ECT处理期间，E组和F组大鼠吸入50% O2，维持其正常呼吸功能。

1.3 大鼠行为学检测

1.3.1 糖水偏好实验  以糖水偏爱百分比（sucrose preference percentage，SPP）作为衡量指标。实验前，训练动物适应含糖饮水，每笼放置两个水瓶。第一个24 h，两瓶均装有1%蔗糖水;随后的24 h，一瓶装1%蔗糖水，另一瓶装纯水。24 h禁食禁水后进行糖水偏好实验：同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水，24 h后取走两瓶并称重，计算大鼠总液体消耗、糖水消耗及SPP。SPP=（糖水消耗/总液体消耗）×100%[4]。

1.3.2 Morris水迷宫实验  建模前后及实验处理后，各进行1次Morris水迷宫实验。水箱分为SE、SW、NW、NE 4个象限。第1～5天进行逃避潜伏期（escape latency，EL）实验：将NE象限设置为目标象限，每只大鼠随机选定1个入水象限，然后按照逆时针方向依次从各象限入水，从入水开始计时，到登上平台为止，记录为EL;若大鼠60 s内未上平台，将其引上平台，并计EL为60 s。取第3～5天的平均值作为EL最终成绩。大鼠第6天进行空间探索实验：撤除目标象限中的平台，让大鼠从目标象限的对侧象限入水，记录大鼠60 s时间内在目标象限的停留时间为空间探索时间（space exploration time，SET）[4]。

1.4 逆转录PCR（Rt-PCR）分析

每组取6只大鼠分离海马并提取RNA。根据基因库tPA、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET1及GAPDH的序列，设计tPA的上游引物为5′-AGAGAGGTTTC-CACCCCATC-3′，下游引物为5′-CTGTCCAGTCAG-GGAGCTGT-3′;DNMT1的上游引物为5′- CAGAT-GTTCCATGCACACT -3′，下游引物为5′- TGTGGATG-TAGGAAAGTTGCA-3′;DNMT3a的上游引物为5′-AGGGACATGGGGGCAAACT-3′，下游引物为5′-GC-AAGAAACAAAAACCCAAAC-3′;DNMT3b的上游引物为5′-GGACTACTTTGCATGTGAATA-3′，下游引物为5′-GCTGTTGTTTTGGTATCTTAG-3′;TET1的上游引物为5′-TGGCCAGAAGGGAAAAGCAA-3′，下游引物为5′-TAATCACCCACTTGGCGACC-3′;GAPDH的上游引物为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGA-3′，下游引物为5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。将逆转录产物进行扩增，扩增条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，47℃延伸30 s，31个循环后72℃补充延伸3 min。取等量扩增产物电泳，使用凝胶发光图像分析系统显影，目的mRNA与GAPDH mRNA比值即为目的mRNA相对表达水平。

1.5 Western blot分析

每组取6只大鼠分离海马并提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白与上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，样品经电泳后电转至PVDF膜上，膜经BSA 37℃封闭1 h后与相应一抗[大鼠抗tPA抗体（Abcam，ab157469）、大鼠抗DNMT1抗体（Abcam，ab188453）及大鼠抗GAPDH抗体（上海碧云天生物技术研究所，AF0006）]结合，4℃孵育过夜。冲洗后滴加辣根过氧化酶标记的二抗37℃温孵2 h，漂洗后采用ECL法显色，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.6 MeDIP-定量聚合酶链反应

各组采用Qiagen基因组DNA提取试剂盒提取6只大鼠海马DNA并检测其纯度及完整性;采用超声仪对DNA进行随机片段化（400～500 bp），并取5 μL于2%琼脂糖凝胶电泳;加热变性后将单链DNA样品分成两份，其中一份作为IP加入抗5-mC抗体，另一份作为input抗体。使用免疫磁珠分离上述样品中甲基化DNA片段的抗体复合物，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化免疫共沉淀的甲基化DNA片段（MeDIP）并检测DNA浓度。qPCR在荧光定量PCR 仪（ABI，StepOnePlus）上进行，分别记录Ct值，用Ctinput和CtMeDIP表示。tPA的甲基化率=2 （Ctinput-CtMeDIP）×100%。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示，并行方差齐性检验。部分行为学数据采用重复测量数据的方差分析，其余数据采用单因素方差分析且两两比较采用LSD-t法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠CUMS建模前后及ECT处理后SPP和Morris水迷宫结果比较

CUMS建模前，各组大鼠SPP比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;CUMS建模后，与C组比较，D组、E组及F组SPP下降，EL明显延长、SET明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）;ECT处理后，与D组比较，E组、F组SPP明显升高、EL明显延长、SET明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）;与C组比较，D组及F组SPP下降，且D组、E组及F组EL明显延长、SET明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 海马各分区tPA、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及TET1 mRNA表达情况

各组大鼠海马CA1区tPA及DNMT1 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;CA3区及DG区tPA及DNMT1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与C组比较，D组、E组和F组tPA mRNA表达水平降低，DNMT1 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与D组比较，E组和F组tPA mRNA表达水平降低，DNMT1 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与E组比较，F组tPA mRNA表达水平升高，DNMT1 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组大鼠海马各区DNMT3a、DNMT3b及TET1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠海马CA1区tPA及DNMT1蛋白相对表达水平及tPA启动子区甲基化率比较

各组大鼠海马CA1区tPA及DNMT1的蛋白相对表达水平及tPA启动子区甲基化率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。与C组比较，D 组、E组和F组tPA蛋白相对表达水平降低，DNMT1蛋白相对表达水平及tPA启动子区甲基化率升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与D组比较，E组和F组tPA蛋白相对表达水平降低，DNMT1蛋白相对表达水平及tPA启动子区甲基化率升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与E组比較，F组tPA蛋白相对表达水平升高，DNMT1蛋白相对表达水平及tPA启动子区甲基化率降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1，表3。

3 讨论

本研究结果发现，抑郁造模降低了大鼠的SPP，增加其EL，缩短SET，大鼠表现出抑郁行为和学习记忆功能的下降。尽管ECT处理能够提高抑郁大鼠的SPP，改善其抑郁样行为，但同时增加了大鼠的EL及缩短了SET，大鼠表现出学习记忆功能的损伤。然而，丙泊酚预处理有效改善ECT后抑郁大鼠的学习记忆功能。

本课题组前期研究显示，海马内tPA的表达变化是调节抑郁大鼠ECT后学习记忆功能改变的重要原因[4]。本研究结果进一步明确，抑郁大鼠ECT后学习记忆功能的损伤仅与海马CA1区tPA基因及蛋白的表达下调相关，丙泊酚预处理能够减少抑郁大鼠海马CA1区tPA基因及蛋白的表达下调，改善抑郁大鼠的学习记忆功能。这一结果与之前研究中电生理实验的结果相符，提示海马CA1区是调节抑郁大鼠ECT后学习记忆功能的关键区域。真核生物基因的表达受到多种遗传因素的共同调控[9-12]。近年来，有关于DNA启动子区域甲基化及去甲基化的表观遗传学修饰机制是诸多学者关注的重点[13-15]。新近的研究显示，DNA甲基化是长期记忆形成和维持的分子机制之一，可通过影响突触相关蛋白的表达来调控突触可塑性和学习记忆[16-17]。Levenson等[18]通过使用DNMTs抑制剂干预离体小鼠海马的脑片后发现， 记忆促进相关基因启动子区域甲基化减少，海马脑片长时程记忆减弱，提示DNA甲基化参与了中枢神经系统突触可塑性。Miller等[19]也发现，大鼠在条件性恐惧记忆形成过程中，海马区蛋白磷酸酶1 基因甲基化水平增高，应用DNMTs抑制剂可以逆转其甲基化，阻碍了恐惧记忆的形成。研究显示DNA甲基化也能够影响到神经细胞tPA 的表达水平。体外实验证实，乙醇孵育能够下调星形胶质细胞内tPA mRNA及蛋白质的表达，而加入DNMT抑制剂后能够明显的增加该细胞内tPA的表达[20]。对于去甲基化酶TET1的研究则显示，TET1 基因敲除小鼠海马区神经元生成障碍伴学习记忆能力损伤，同时与前体细胞分化相关的基因表现为高甲基化和表达下调，提示TET1与神经元前体细胞的分化以及学习记忆等认知功能密切相关[21]。为了进一步明确丙泊酚对接受ECT的抑郁大鼠海马tPA基因甲基化的影响，本实验观察了海马各区甲基化酶及去甲基化酶的表达变化，结果显示海马CA1区DNMT1的表达变化可能与接受不同处理抑郁大鼠的学习记忆功能变化相关。此外，本研究结果同时发现海马各分区DNMT3a、DNMT3b及TET1并未参与抑郁大鼠学习记忆功能的变化，提示海马CA1区的DNMT1的改变可能是影响tPA基因表达的核心因素。鉴于DNA的甲基化酶及去甲基化酶均为非特异性酶，可作用于多种基因，本研究进一步验证了tPA启动子区域的甲基化状态。本研究结果显示，与海马CA1区的DNMT1表达变化趋势相符，抑郁能够增加海马CA1区tPA启动子区域的甲基化水平，ECT则进一步增加了tPA的甲基化，丙泊酚能够减轻ECT引起的tPA甲基化改变，推测丙泊酚可以通过减少海马CA1区DNMT1的表达，抑制tPA启动子区域的甲基化水平，进而增加tPA蛋白及mRNA的表达水平，在ECT的治疗过程中发挥学习记忆功能的保护作用。

鑒于DNMT抑制剂作用的广谱性，因此本研究无法使用DNMT抑制剂特异性下调DNMT1的表达，进一步验证tPA的表达变化对大鼠学习记忆功能的影响，这可能是本研究的主要不足之处[22-23]。此外，表观遗传学机制尚涉及组蛋白的乙酰化/去乙酰化等，这些机制是否参与了丙泊酚对抑郁大鼠电休克处理的学习记忆保护作用尚不明确，后续需进一步深入研究[24-25]。

综上所述，丙泊酚能够有效减轻抑郁大鼠ETC后的学习记忆损伤，其机制可能与下调海马CA1区DNMT1表达减轻tPA启动区域的甲基化水平，增加tPA mRNA及蛋白表达水平有关。

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（收稿日期：2020-04-14）