木香对非小细胞肺癌中吉非替尼耐药的影响

童艳丽 黄冠 梅清华

[摘要] 目的 观察云木香和印木香联合吉非替尼对非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药线虫模型的影响，初步探讨其主要有效成分。 方法 采用基因型人体化（LET-23：：hEGFR-TK[T790M- L858R]）的秀丽隐杆线虫突变体jgIs25，确定云木香和印木香的有效抑制浓度，并利用高效液相色谱法（Hypersil BDS C18 250 mm×4.6 mm，5 μm，检测波长：220 nm）初步确定其有效活性成分。 结果 当印木香浓度在100～750 μg/mL、云木香浓度在500～750 μg/mL时，对秀丽隐杆线虫突变体jgIs25阴门表达影响的差异有高度统计学意义（P < 0.01），初步推测活性单体为木香烃内酯、去氢木香内酯。 结论 木香联合吉非替尼可逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药，为后续临床研究提供基础。

[关键词] 木香;非小细胞肺癌;表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂;线虫

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（a）-0029-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Saussurea costus and Indian costus combined with Gefitinib on the model of C. elegans which was resistant to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors （EGFR-TKI）， and to research the main effective active components. Methods Genotyped anthropogenic （LET-23：：hEGFR-TK[T790M- L858R]） C. elegans mutant jgIs25 was used to ensure the effective inhibitory concentration of Saussurea costus and Indian costus. The effective active components were preliminarily determined by HPLC （Hypersil BDS C18 250 mm×4.6 mm， 5 μm， detection wavelength： 220 nm）. Results There were significant differences in the vulva expression of C. elegans jgIs25， when the concentration of Indian costus was 100-750 μg/mL and Saussurea costus was 500-750 μg/mL （P < 0.01）. It was preliminarily speculated that the active monomers were costunolide and dehydrocostus lactone. Conclusion Radix Aucklandiae combined with Gefitinib can reverse EGFR-TKI resistance in non-small cell lung cancer. It can provide the basis for the follow-up clinical research.

[Key words] Radix Aucklandiae; Non-small cell lung cancer; Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors; C. elegans

一代表皮生長因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）是晚期非小细胞肺癌的一线靶向治疗药物，但多在患者中位生存时间9个月后出现耐药，主要由于EGFR20外显子T790M发生突变（约占50%[1-2]）。针对上述耐药机制，国外三代不可逆EGFR-TKI（目前仅有一种新药奥西替尼上市[3]）奥西替尼对T790M突变患者具有较好的反应率，相对于无突变患者，中位无进展生存期为9.6～13.5个月[4-10]，但临床治疗费用高，并不能使经济状况一般的患者从中获益。中药的生物活性化合物的发掘是新药研发的来源之一[11-18]。秀丽隐杆线虫与哺乳动物EGFR信号通路同源[19]，利用此线虫构建基因型为LET-23：：hEGFR-TK[T790M-L858R]的秀丽隐杆线虫突变体jgIs25，可以用于中药逆转肺癌耐药的药效筛选模型。

1 材料与方法

1.1 材料

线虫模型：基因型LET-23：：hEGFR-TK[T790M-L858R]的秀丽隐杆线虫突变体jgIs25，由韩国国家癌症研究中心Jaegal Shim教授赠送。印木香购自Med Com for Trading & Import. Co.， Ltd;云木香购自广东天成药业有限公司（分别经过广东省第二人民医院副主任中药师陈燕鉴定为印木香和云木香）。二甲基亚砜（DMSO）购自上海阿拉丁试剂公司;琼脂粉和蛋白胨购自上海国药集团化学试剂有限公司;吉非替尼（420019，CAS 184475-35-2）、木香烃内酯（111524）、绿原酸（110753）和咖啡酸（110885）等对照品为中国食品药品检定研究院出品;去氢木香内酯对照品（A0301）购自北京中科质检生物技术有限公司;叠氮化钠、磷酸、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯，购自广州化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制备  取印木香和云木香研磨成粉末，过40目筛网，精密称取10 g，100 mL 70%乙醇加热回流1 h，4000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，残渣加70%乙醇继续加热回流1 h，将2次所得上清液转移至250 mL的圆底烧瓶中，旋蒸至膏状，取出，置于冷冻干燥箱中，干燥24 h，将粉末置于-20℃冰箱中保存待用。

1.2.2 液体板的制备  将L1期的秀丽隐杆线虫突变体jgIs25离心浓缩，平铺于48孔板中，每孔终浓度为20只/200 μL。实验组加入吉非替尼和不同浓度的中药提取物，对照组单独加入吉非替尼，两组吉非替尼终浓度为5 μm。印木香和云木香提取物的终浓度50～4000 μg/mL。将制备好的48孔板置入20℃恒温摇床中培养72 h至L4期，每个实验组重复3次。

1.2.3 秀丽隐杆线虫突变体jgIs25阴门表达的观察  将48孔板中处于L4期线虫液体移至EP管中，离心，移除上清液，加入2 mmol/L叠氮化钠溶液麻醉后移至浮游生物计数板上，在倒置显微镜下观察并计算秀丽隐杆线虫突变体jgIs25阴门表达的比例。

1.2.4 色谱条件  色谱柱：大连依利特BDS C18色谱柱（Hypersil BDS C18）（250 mm×4.6 mm，5 μm）;检测波长：220 nm;流速：1 mL/min;流动相：A. 0.1%磷酸水溶液，B.甲醇（0 min，90% A;15 min，60% A;60 min 30% A;80 min 10% A）;进样量20 μL。

1.3 统计学方法

数据统计和图表绘制使用origin 8.5。采用SPSS 19.0对所得数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 印木香和云木香提取物对秀丽隐杆线虫突变体jgIs25阴门表达的影响

与对照组（control）比较，当印木香浓度在100～750 μg/mL、云木香浓度在500～750 μg/mL时，对阴门表达的影响差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见图1～2。

2.2 指纹图谱

用甲醇配制木香烃内酯、去氢木香内酯、绿原酸和咖啡酸对照品混合溶液，浓度均为0.1 mg/mL。采用相同的高效液相色谱条件对对照品溶液、印木香和云木香提取物溶液进行分析，印木香和云木香提取物的4种主要成分的出峰时间与对照品一致。见图3～5。

1.绿原酸;2.咖啡酸;3.木香烃内酯;4.去氢木香内酯

1.绿原酸;2.咖啡酸;3.木香烃内酯;4.去氢木香内酯

1.绿原酸;2.咖啡酸;3.木香烃内酯;4.去氢木香内酯

3 讨论

本研究采用线虫模型，其具有人体类似EGFR-Ras-MAPK信号通路，通过转基因技术构建模拟针对非小细胞肺癌一代EGFR-TKI耐药患者（同时具备EGFR-TK21外显子L858点突变和20外显子T790出现突变）的线虫模型（秀丽隐杆线虫突变体jgIs25），筛选可逆转一代EGFR-TKI代表药物吉非替尼耐药的中药，发现云木香和印木香在500～750 μg/mL浓度范围内可对突变基因表达产生抑制作用，恢复吉非替尼对耐药基因的敏感性。实验采用绿原酸、咖啡酸、木香烃内酯和去氢木香内酯作为对照品，对实验用印木香和云木香进行了指纹图谱鉴定，通过指纹图谱发现木香烃内酯、去氢木香内酯占主要成分。吴蒙等[20]研究发现，木香内酯可抑制肺癌细胞H460生长，因此推测两者与抑制秀丽隐杆线虫突变体阴门的表达有较大关系。本实验通过对印木香和云木香提取物进行研究，提示中药能够逆转吉非替尼这类EGFR-TKI的肺癌耐药，丰富了祖国中医中药的抗癌理论。

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（收稿日期：2019-10-10）