沉默VEGF基因对腺样囊性癌细胞侵袭的影响

黄燕婷　劳均平

【摘要】 目的：利用RNAi技术沉默腺样囊性癌细胞株ACC-2中VEGF的表达，探讨其对肿瘤细胞侵袭能力的影响。方法：利用RNAi技术沉默VEGF表达，用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力的变化。结果：与对照组比较，VEGF的siRNA能有效地抑制实验组ACC-2细胞的侵袭能力。结论：沉默VEGF减弱腺样囊性癌的侵袭能力。

【关键词】 涎腺腺样囊性癌； 血管内皮生长因子； RNA干扰； 侵袭

The Study of the Influence on Invasiveness Activity of ACC-2 Cells Via RNAi VEGF/HUANG Yan-ting，LAO Jun-ping.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：037-038

【Abstract】 Objective：To investigate the inhibitory effects of VEGF targeted small interference RNA（siRNA） on invasiveness of salivary adenoid cystic carcinoma（SACC） cell line ACC-2. Method： VEGFsiRNA was transfect into SACC cell line ACC-2 and then examine the changes of invasive ability of ACC-M. Result： The invasive and proliferative abilities of ACC-2 decreased， and the difference between the two groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion：Si-VEGF can effectively decrease invasiveness of SACC cells.

【Key words】 Salivary adenoid cystic carcinoma； Vasculare endothelial growth factor； RNA interference； Invasiveness

First-authors address：The First Peoples Hospital of Foshan City，Foshan 528000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.013

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，约占口腔恶性肿瘤的六分之一。腺样囊性癌具有嗜神经侵袭以及跳跃性转移的特点。手术预后差，侵袭以及转移是患者的主要病因之一[1-2]。

血管内皮生长因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一种强烈诱导血管生成的细胞因子，在肾癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌、子宫内膜癌以及胚胎组织性肿瘤中多有报道。肿瘤组织中VEGF表达水平与恶性程度成正相关，并明显高于非肿瘤组织[3-4]。这表明VEGF可能通过促进血管形成等方式促进肿瘤的生长，尤其在高度血管化的肿瘤中。VEGF及其受体是血管生成的关键因子，其过度表达与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[5]。

1 资料与方法

1.1 细胞培养 腺样囊性癌细胞系低转移株（ACC-2）由中山大学附属孙逸仙医院李劲松教授馈赠。两株细胞培养于10%的FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37 ℃，5%（v/v）CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。

1.2 siRNA的设计和转染 VEGF特异性干扰片段参照之前文献设计。片段序列为：GGCGTCGCACTGAAACTTT，由吉玛生物合成。

1.3 mRNA的提取和检测 细胞株的mRNA的提取和cDNA的合成。TRIzol法提取细胞株中总的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反转录试剂盒（Promega）。VEGF引物的设计如下：VEGF基因：上游引物：5-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3；下游引物：5-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3。内参GAPDH基因：上游引物：5-GCCTCAAGATCATCAGCAATGC-3；下游引物：5-CATGGACTGTGGTCATGAGTCTT-3。

1.4 Western Blot检测VEGF蛋白的表达 分别收集转染48 h后的ACC-2细胞，用预冷的PBS洗涤，加入蛋白裂解液，提取总蛋白。分别取50 μg蛋白，97 ℃变性后，经10% SDS-PAGE分离，将凝胶置于转移平衡缓冲液中，再以200 V行电泳跑胶，时间1 h。再以25 V电压1.5 h将蛋白转移到PVDF膜上；5%脱脂牛奶（TBST溶解）封闭1 h；10%FBS/TBST加一抗4 ℃孵育过夜；漂洗TBST 3次，

10 min/次；10%FBS/TBST加二抗室温下孵育1 h，漂洗TBST 3次，10 min/次。取等量的ECL发光试剂A、B液，混匀后，孵育硝酸纤维素膜，曝光，以GAPDH为内参。

1.5 Transwell实验 细胞培养至对数生长期，以无血清的DMEM培养基培养细胞，“饥饿”12 h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用无血清DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度至5×105个/mL单细胞悬液。取细胞悬液100 ?L加入Transwell小室，设3个复孔。24孔板下室加入450 ?L含10%FBS的细胞培养基。细胞培养48 h，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。采用0.1%结晶紫染色。选择相同位置的3个视野进行计数。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测结果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白产物在转染后，实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

3 讨论

血管内皮生长因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一种强烈诱导血管生成的细胞因子，VEGF的表达广泛见于肿瘤及非肿瘤的病理过程中，它的表达与转化生长因子B（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、NO以及一些重金属离子有关，还受缺血和缺氧环境的调节[6]。肿瘤组织中VEGF表达水平与恶性程度成正相关，并明显高于非肿瘤组织[7]。这表明VEGF可能通过促进血管形成等方式促进肿瘤的生长，尤其在高度血管化的肿瘤中[8-10]。VEGF及其受体是血管生成的关键因子，其过度表达能从多方面影响肿瘤的脉管生成，加速肿瘤转移，与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[11-12]。本研究通过沉默VEGF基因从而降低ACC-2的侵袭能力。揭示了VEGF的对ACC-2侵袭的调控能力，但针对ACC-2侵袭的调控的具体信号通路还需要做进一步的研究。并且需要做动物实验验证，希望以后可以为以VEGF为靶点的恶性肿瘤的生物治疗提供理论的依据。

参考文献

[1] Tian Z， Li L， Wang L， et al. Salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions： a 23-year retrospective study of 6982 cases in an eastern Chinese population[J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2010， 39（10）：235-242.

[2]劳均平，梁军，欧阳可雄.RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性的影响[J].中国医学创新，2013，27（273）：6-8.

[3] Kourembanas S， Mcquillan L P， Leung G K， et al. Nitric oxide regulated the expression of vasoconstrictors and growth factor by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia[J]. J Clin Invest， 1993， 92（5）：99-104.

[4] Assal O N， Yamanoi A， Soda Y， et al. Clinical significance of microvessle density and vascular endothelial growth factor expretion in hepatocellular carcinoma and surrounding liver： possible involvement of vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of cirrhotic liver[J]. Hepatology， 1998， 27（5）：1554-1562.

[5] Lee J C， Chow N H， Wang S T， et a1.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in eolorectal cancer patients[J].Eur J Cancer，2000，36（6）：748-753.

[6] Jiang B H， Semenza G L， Bauer C， et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol， 1996， 271（7）： 1172-1182.

[7] Mise M， Arii S， Higashituji H， et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology， 1996， 23（10）： 455-464.

[8] Hatva E， Bohling T， Jaaskelainen J， et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol， 1996， 148（7）： 763-775.

[9] Cornali E， Zietz C， Benelli R， et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol， 1996， 149（8）： 1851-1869.

[10]宋洪生，吴芳.外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响[J].中国医学创新，2013，10（1）：3-5.

[11]史玉岭.夹心ELISA检测血清结缔组织生长因子及其初步临床应用[J].中国医学创新，2011，8（30）：9-11.

[12]罗伟，冀林华，李占全，等.急性白血病患者血浆VEGF测定及其临床意义[J].中国医学创新，2013，10（14）：70-71.

（收稿日期：2014-02-17） （本文编辑：黄新珍）

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测结果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白产物在转染后，实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

3 讨论

血管内皮生长因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一种强烈诱导血管生成的细胞因子，VEGF的表达广泛见于肿瘤及非肿瘤的病理过程中，它的表达与转化生长因子B（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、NO以及一些重金属离子有关，还受缺血和缺氧环境的调节[6]。肿瘤组织中VEGF表达水平与恶性程度成正相关，并明显高于非肿瘤组织[7]。这表明VEGF可能通过促进血管形成等方式促进肿瘤的生长，尤其在高度血管化的肿瘤中[8-10]。VEGF及其受体是血管生成的关键因子，其过度表达能从多方面影响肿瘤的脉管生成，加速肿瘤转移，与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[11-12]。本研究通过沉默VEGF基因从而降低ACC-2的侵袭能力。揭示了VEGF的对ACC-2侵袭的调控能力，但针对ACC-2侵袭的调控的具体信号通路还需要做进一步的研究。并且需要做动物实验验证，希望以后可以为以VEGF为靶点的恶性肿瘤的生物治疗提供理论的依据。

参考文献

[1] Tian Z， Li L， Wang L， et al. Salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions： a 23-year retrospective study of 6982 cases in an eastern Chinese population[J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2010， 39（10）：235-242.

[2]劳均平，梁军，欧阳可雄.RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性的影响[J].中国医学创新，2013，27（273）：6-8.

[3] Kourembanas S， Mcquillan L P， Leung G K， et al. Nitric oxide regulated the expression of vasoconstrictors and growth factor by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia[J]. J Clin Invest， 1993， 92（5）：99-104.

[4] Assal O N， Yamanoi A， Soda Y， et al. Clinical significance of microvessle density and vascular endothelial growth factor expretion in hepatocellular carcinoma and surrounding liver： possible involvement of vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of cirrhotic liver[J]. Hepatology， 1998， 27（5）：1554-1562.

[5] Lee J C， Chow N H， Wang S T， et a1.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in eolorectal cancer patients[J].Eur J Cancer，2000，36（6）：748-753.

[6] Jiang B H， Semenza G L， Bauer C， et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol， 1996， 271（7）： 1172-1182.

[7] Mise M， Arii S， Higashituji H， et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology， 1996， 23（10）： 455-464.

[8] Hatva E， Bohling T， Jaaskelainen J， et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol， 1996， 148（7）： 763-775.

[9] Cornali E， Zietz C， Benelli R， et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol， 1996， 149（8）： 1851-1869.

[10]宋洪生，吴芳.外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响[J].中国医学创新，2013，10（1）：3-5.

[11]史玉岭.夹心ELISA检测血清结缔组织生长因子及其初步临床应用[J].中国医学创新，2011，8（30）：9-11.

[12]罗伟，冀林华，李占全，等.急性白血病患者血浆VEGF测定及其临床意义[J].中国医学创新，2013，10（14）：70-71.

（收稿日期：2014-02-17） （本文编辑：黄新珍）

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测结果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白产物在转染后，实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

3 讨论

血管内皮生长因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一种强烈诱导血管生成的细胞因子，VEGF的表达广泛见于肿瘤及非肿瘤的病理过程中，它的表达与转化生长因子B（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、NO以及一些重金属离子有关，还受缺血和缺氧环境的调节[6]。肿瘤组织中VEGF表达水平与恶性程度成正相关，并明显高于非肿瘤组织[7]。这表明VEGF可能通过促进血管形成等方式促进肿瘤的生长，尤其在高度血管化的肿瘤中[8-10]。VEGF及其受体是血管生成的关键因子，其过度表达能从多方面影响肿瘤的脉管生成，加速肿瘤转移，与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[11-12]。本研究通过沉默VEGF基因从而降低ACC-2的侵袭能力。揭示了VEGF的对ACC-2侵袭的调控能力，但针对ACC-2侵袭的调控的具体信号通路还需要做进一步的研究。并且需要做动物实验验证，希望以后可以为以VEGF为靶点的恶性肿瘤的生物治疗提供理论的依据。

参考文献

[1] Tian Z， Li L， Wang L， et al. Salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions： a 23-year retrospective study of 6982 cases in an eastern Chinese population[J]. Int J Oral Maxillofac Surg，2010， 39（10）：235-242.

[2]劳均平，梁军，欧阳可雄.RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性的影响[J].中国医学创新，2013，27（273）：6-8.

[3] Kourembanas S， Mcquillan L P， Leung G K， et al. Nitric oxide regulated the expression of vasoconstrictors and growth factor by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia[J]. J Clin Invest， 1993， 92（5）：99-104.

[4] Assal O N， Yamanoi A， Soda Y， et al. Clinical significance of microvessle density and vascular endothelial growth factor expretion in hepatocellular carcinoma and surrounding liver： possible involvement of vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of cirrhotic liver[J]. Hepatology， 1998， 27（5）：1554-1562.

[5] Lee J C， Chow N H， Wang S T， et a1.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in eolorectal cancer patients[J].Eur J Cancer，2000，36（6）：748-753.

[6] Jiang B H， Semenza G L， Bauer C， et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol， 1996， 271（7）： 1172-1182.

[7] Mise M， Arii S， Higashituji H， et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology， 1996， 23（10）： 455-464.

[8] Hatva E， Bohling T， Jaaskelainen J， et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol， 1996， 148（7）： 763-775.

[9] Cornali E， Zietz C， Benelli R， et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol， 1996， 149（8）： 1851-1869.

[10]宋洪生，吴芳.外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响[J].中国医学创新，2013，10（1）：3-5.

[11]史玉岭.夹心ELISA检测血清结缔组织生长因子及其初步临床应用[J].中国医学创新，2011，8（30）：9-11.

[12]罗伟，冀林华，李占全，等.急性白血病患者血浆VEGF测定及其临床意义[J].中国医学创新，2013，10（14）：70-71.

（收稿日期：2014-02-17） （本文编辑：黄新珍）