趋化因子受体CXCR2在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

郑正荣++++++叶凯++++++孙亚锋++++++赵清泉++++++许建华

[摘要] 目的 探讨结直肠癌患者组织中趋化因子受体CXCR2的表达水平及其对临床上结直肠癌侵袭、转移等预后的影响。 方法 以46例大肠癌、20例结肠息肉或腺瘤、30例正常结肠黏膜为研究对象，采用免疫组织化学SP法及RT-PCR法检测组织中CXCR2的蛋白质定量及mRNA半定量水平，并根据临床病理特征进行对照分析。 结果 CXCR2表达水平（蛋白水平及mRNA水平）在结直肠癌组织与大肠良性肿瘤组织中差异有统计学意义（P<0.05）；CXCR2表达水平在肠癌组织与正常结肠组织中差异有统计学意义（P<0.05）；CXCR2表达水平在肠癌淋巴结转移患者与未转移患者中差异有统计学意义（P<0.05）；不同分化程度肠癌CXCR2表达水平差异有统计学意义（P<0.05）；结直肠癌中CXCR2的表达与临床分期相关。 结论 结直肠癌细胞浸润、转移过程中可能有趋化因子受体CXCR2的参与，临床上对肠癌组织CXCR2的检测对其侵袭、转移生物学行为的预测具有重要的意义。

[关键词] 趋化因子受体；CXCR2；结直肠肿瘤；侵袭；转移

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（a）-0009-05

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈上升趋势。由于结直肠癌手术时多已存在微转移灶，故结肠癌患者行根治术后，仍有25%～30%的患者出现复发。许多学者正在寻找一些客观生物指标，用于结直肠癌的早期诊断及预测侵袭、转移及复发情况。目前趋化因子受体CXCR2与肿瘤的侵袭生长及转移关系的研究正成为一个新的热点。CXCR2是趋化因子CXC亚家族的受体，与其特异性配体相作用可触发细胞内多种信号传导，从而介导细胞参与各种生理和病理过程[1]。在某些肿瘤细胞中CXCR2可高表达，可在肿瘤的转移和侵袭中发挥作用。本研究应用免疫组织化学SP法及RT-PCR方法检测结直肠良性肿瘤（息肉和腺瘤）、结直肠癌组织标本中CXCR2的蛋白质及mRNA水平的表达。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年9月～2013年9月于本院行手术治疗的结直肠癌患者，完整病例资料且符合实验条件入组病例共46例，其中男性27例，女性19例，平均年龄50.1岁。手术切除标本经病理科按流程标准处理，有经验病理科医师HE染色于镜下证实。同时取结直肠良性肿瘤（息肉或腺瘤）对照患者共20例，其中男性13例，女性 7例，平均年龄45.5岁。所有患者术前均未接受过其他相关治疗。

1.2 试剂、仪器

1.2.1 免疫组织化学相关试剂 Elivision plus试剂盒（KIT-9901）购自福州迈新；鼠抗人CXCR2多克隆抗体（SC-683）：浓缩型，工作浓度为1∶200，购自SANTA CRUZ生物公司。

1.2.2 RT-PCR方法相关试剂 CXCR2引物序列（上游引物：5′-CAGCGACCCAGTCAG GATTTA-3′，5′-ACCAG CATCACGAGGGAGTTT-3′，产物251 bp）及内参引物序列（β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTC AACA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，产物318 bp）由北京三博远志公司合成。ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）购自Fermentas公司，Trizol、DEPC购自Invitrigeon公司，主要仪器：PCR仪（美国PE2400），凝胶电泳仪（DYY-Ⅲ8B），高速冷冻离心机（TGL-16G），凝胶成像系统。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 于临床手术中下标本后30 min内，取新鲜相关组织置于-80℃冰箱中冻存备用。

1.3.2 反转录聚合酶链反应检测 充分匀浆鲜冻手术标本组织并提取总RNA，取总RNA 3 μg，加入随机引物oligo（dT）18 1 μl，70℃共孵育5 min，依次加入2.5 μl 10×reaction buffer、1 μl Rnasin（20 U/μl）、10 mmol/L dNTPs 2 μl，37℃孵育5 min，添加1 μl M-MuLV反转录酶（200 U/μl），42℃反应60 min，合成第一链cDNA，70℃孵育10 min，终止反应；以此cDNA模板进行下一步实验，PCR体系成分（总体积至25 μl）：1 μl Taq合酶（1 U/μl），1 U 10 μmol/L的上游引物、1 U 10 μmol/L的下游引物、2.5 μl 10×PCR缓冲液、0.5 μl 10 mmol/L dNTPs、1.0 μl 25 mmol/L MgCl2、去离子水补充。所需PCR条件设置：94℃变性45 s，60℃复性45 s，72℃延伸50 s，共28个循环，72℃再延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，凝胶成像系统对电泳胶进行摄像，分析数据。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，计量资料用x±s表示，采用t检验，计数资料用率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR2在正常大肠黏膜、恶、良性肿瘤组织中的表达

2.1.1 免疫组织化学SP法染色结果 CXCR2蛋白水平在癌细胞中细胞膜和（或）细胞质内呈中-强染色，相比之下在良性肿瘤、正常大肠黏膜中，呈现出较弱染色甚至是无染色（图1～图3）。在该组病例中，CXCR2阳性表达率为69.6%，正常黏膜及良性肿瘤中CXCR2阳性表达率分别为33.3%和35.0%。

2.1.2 RT-PCR结果 较之良性肿瘤及相应正常黏膜，大肠癌组织标本中CXCR2 mRNA的表达量明显升高，而各组中β-actin的表达相对均一（图4）。

在蛋白水平及mRNA水平，CXCR2表达的检出率与上述CXCR2阳性表达率相当，在所选大肠癌病例中，CXCR2阳性表达率为69.6%，在正常大肠黏膜及良性肿瘤中CXCR2阳性表达率分别为33.3%和45.0%。

2.2 CXCR2在各组织中的含量

正常黏膜、良性肿瘤组织和大肠癌组织之间，CXCR2的含量差异有统计学意义（P<0.05）。正常黏膜组织和良性肿瘤之间CXCR2的含量差异无统计学意义（P>0.05）（表1、表2）。

2.3 结直肠癌组织CXCR2表达水平与临床病理特征间的关系

无淋巴结转移患者和有淋巴结转移患者的CXCR2表达差异有统计学意义（P<0.05），低分化癌患者与高分化癌患者的CXCR2表达差异有统计学意义（P<0.05）。临床分期与CXCR2表达有相关性（P<0.05）。临床病理特征中年龄、性别、肿瘤部位、是否肝转移等因素与组织中CXCR2表达无相关性（P>0.05）。在免疫组织化学及RT-PCR法的检测中得到相同的结论（表3、表4）。

3 讨论

趋化因子受体可参与多种生理和病理过程[1]。趋化因子及趋化因子受体都在在肿瘤细胞迁移、转移和侵袭过程中有起重要作用[2]。国外已有实验表明肿瘤的转移部分受趋化因子的调控，多种趋化因子都与肿瘤细胞所表达的相对应受体有关。已有大量证据表明肿瘤的生长和扩散转移与血管形成密切相关，血管生成是肿瘤转移的前提和基础。因此新生血管形成是转移连锁过程开始的关键环节。

CXCR2作为IL-8的受体之一（IL-8RB），通常被认为通过与IL-8的相互作用主要在血管生成方面发挥效应。因此诸多学者认为CXCR2可能在肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色，Glu-Leu-Arg（+）[ELR（+）]类CXC趋化因子，是血管发生的有力促进因子，已经被证明可以诱导肺非小细胞肺癌的血管生成活性。[ELR（+）]类CXC趋化因子有一个共同的受体即CXCR2。利用同系基因型Lewis肺癌细胞种植于C57BL/6鼠模型，分为CXCR2阳性组及CXCR2缺失组，首先显示[ELR（+）]类CXC趋化因子与肿瘤的生长增殖及转移有密切的关系。其次发现在CXCR2缺失组鼠体中肿瘤的生长受到抑制，更甚，CXCR2缺失组鼠体中肿瘤的自发肺部转移显著减弱。形态测定分析发现CXCR2缺失组鼠体中原发肿瘤的肿瘤坏死比CXCR2阳性组明显加强。实验更进一步证实了CXCR2在介导[ELR（+）]类CXC趋化因子血管生成中扮演的角色[3]。CXCR2可介导趋化活性和钙动员，诱导肾细胞癌（RCC）中肿瘤相关血管生成从而促进肿瘤生长和转移[4]。已有研究证明恶性结直肠上皮细胞上过表达IL-8及CXCR2，预期通过阻断CXCR2来达到抗肿瘤血管生成从而成为治疗结直肠腺癌的有力靶点[3]。同时在胃癌[6]、前列腺癌[7]细胞株上亦发现不同转移潜能的细胞株CXCR2的表达有差异。国内尚未发现有CXCR2在结直肠肿瘤中表达的相关文献，国外对该因子的研究也仅限于胃癌、前列腺癌、胰腺癌[8]、乳腺癌[9]等。也少见对结直肠癌细胞株[10]的干预，最近文献仅有Erreni等[11]通过结肠癌组织样本与正常组织样本的对比分析发现，CXCR2是结肠癌组织样本中几种显著高表达的细胞因子受体之一。

本研究应用RT-PCR法及免疫组织化学SP法对正常结肠黏膜组织、结肠良性肿瘤、结直肠癌、进行检测，测定这些组织标本中CXCR2的mRNA及蛋白表达，并分析其与临床病理特征之间的关系。

RT-PCR结果显示，癌组织中CXCR2 mRNA的表达高于及正常黏膜组织和良性肿瘤。RT-PCR法及免疫组织化学法对CXCR2表达的检出率一致，在良性肿瘤中阳性率为45.0%；在正常大肠黏膜中阳性率为33.3%。结直肠癌、良性肿瘤、正常黏膜三者之间，CXCR2表达差异有统计学意义（P<0.05）。研究显示，CXCR2的表达与大肠癌的发生有着重要的关系。针对恶性肿瘤临床病理特征的分析结果提示CXCR2表达水平高者，其浸润能力强，淋巴结转移多见，由于许多隐匿性淋巴结转移患者不能被临床所发现，所以检测患者组织中CXCR2表达水平，可为临床提供参考并期望成为评价肿瘤生长和浸润情况的有效指标。本研究结果显示CXCR2含量随分期增加而逐步升高，提示组织CXCR2表达水平还与临床分期密切相关（P<0.05），并且Ⅲ、Ⅳ期与Ⅰ、Ⅱ期相比差异有统计学意义，说明随着临床病期的进展，CXCR2分泌量增高，肿瘤的侵袭能力增强，发生转移的概率增大，预后不良。患者年龄、性别、肿瘤所在部位及肝转移等临床病理特征与组织中CXCR2含量之间差异无统计学意义（P>0.05），提示CXCR2并不参与肿瘤的远处转移。在免疫组织化学及RT-PCR法的检测中得到相同的结论。

结肠癌中血管发生与包括复发率、淋巴结转移率、无瘤生存率等预后参数密切相关。本研究检测了结直肠癌、良性结直肠肿瘤及正常结直肠组织的CXCR2含量，结果说明CXCR2在由正常结肠黏膜或结肠良性肿瘤到结直肠癌的逐步演变过程中起到重要作用。肿瘤浸润程度、淋巴结转移情况是评价恶性肿瘤预后的重要指标[13-20]，本研究发现，结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤所在部位等临床病理特征与CXCR2表达之间无相关性，而与肿瘤的临床分期、分化程度及淋巴结转移密切相关，说明CXCR2表达可能和肿瘤浸润深度和局部淋巴结侵袭转移有明显关系，通过相关文献复习及实验结果，推测CXCR2在肿瘤新生血管形成中扮演着重要的角色，诱导癌细胞的血管生成活性，诱导微血管的增殖和趋化现象，促进局部淋巴结转移、肿瘤细胞的浸润侵袭。

在肿瘤的体外试验阶段特异性阻断趋化因子受体CXCR2信号系统的传递，可以达到抑制肿瘤增殖、侵袭、转移的能力，为抗肿瘤的研究提供了新的思路，这在胰腺癌的靶向治疗方面已经有了初步的实验证据[12]，在结直肠癌中发现有趋化因子受体CXCR2的高表达，也为结直癌的综合治疗提供了可参考的指标和方向。

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（收稿日期：2014-10-14 本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期：2014-10-14 本文编辑：郭静娟）