猪β-防御素1在毕赤酵母中的串联表达

王 鑫，范阔海，尹 伟，孙 娜，孙耀贵，李宏全

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

自青霉素问世以来，人们对病原菌造成的感染性疾病不再束手无策，但是由于细菌对抗菌药物的广泛抑制，发现和开发新型有效的抗菌剂就成为了全世界备受关注的焦点。天然产生的抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)广泛分布于整个动植物界，具有分子量小、热稳定性好、广谱抗菌和作用靶点为病原体细胞膜[1-2]等特点，显示出高效的杀菌能力，被认为是未来最有希望的代替者[3]。防御素(Defensin)是一类在动植物体内广泛存在[4]、分子量大约3～5 kDa，具有抗细菌[5]、真菌[6]、病毒[7]等微生物生物学活性的内源性阳离子抗菌肽，主要来源于上皮组织，是非特异性天然免疫系统的重要组分之一，在肠道稳态和抵抗病原体方面起着至关重要的作用[8]。

猪源防御素家族的结构比较保守[9]，富含半胱氨酸，多聚阳离子型。猪β-防御素可通过直接杀菌作用抑制细菌感染，同时抑制促炎细胞因子的释放减轻炎症反应[10]。高表达β-防御素的猪可抵抗猪病原性胸膜肺炎放线杆菌的感染[11]。猪β-防御素1(Porcine beta-defensin1，pBD1)是猪体内最早发现的防御素，在猪的全身组织及器官中广泛表达，不同品种及不同的生长阶段的猪其表达情况也不尽相同。第1个pBD1基因由Zhang G L等[12]克隆出来，编码64个氨基酸，成熟肽有38个氨基酸。pBD1在大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒表达系统中的表达已有报道。姜丽华等[13]首次在毕赤酵母表达系统中实现了pBD1的分泌表达，表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性，但是表达量较低不适合大规模生产。本试验为了高效表达pBD1蛋白，设计合成pBD1三倍串联基因(3pBD1)，构建重组表达载体pHLI-S1-3pBD1，建立巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)对3pBD1的真核表达系统，为pBD1的进一步大量生产并开发成新型抗菌药提供理论基础和技术路径。

1 材料与方法

1.1 菌株及载体 毕赤酵母宿主菌GS115、大肠杆菌TOP10、酵母表达载体pHIL-S1均为本实验室保存。

1.2 主要试剂 基因组DNA提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；TRIzol Reagent总RNA提取试剂盒，购自美国Invitrogen；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit、E.Z.N.A.®Plasmid Mini Kit I、Prime Script RT-PCR Kit、EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶均，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 方法

1.3.1pBD1三倍串联基因的设计 根据GenBank中pBD1基因(NM_213838.1)的成熟肽序列和巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性设计3pBD1，设计的3pBD1基因全长625 bp，包括202个氨基酸编码区、终止密码子、2个肠激酶识别位点、EcoRⅠ酶切位点和BamHⅠ酶切位点，将设计好的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。3pBD1基因所编码的氨基酸共有202个，分子量约为22 kDa。

1.3.2 重组表达载体pHIL-S1-3pBD1的构建及鉴定 将目的基因3pBD1和表达载体pHIL-S1用BamH Ⅰ/EcoRⅠ进行双酶切反应，双酶切反应体系为：EcoRⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，K-Buffer 2 μL，载体6 μL，ddH2O补齐至20 μL。37 ℃酶切12 h，2%琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收。将上述回收的pHIL-S1和3pBD1进行连接，连接反应体系为：pHIL-S1载体1 μL，3pBD1基因7 μL，T4 DNA连接酶1 μL，10×T4 DNA Buffer 1 μL。利用热激法将连接产物转化至感受态大肠杆菌TOP10，涂布于含有Amp(100 mg/mL)的LB平板37 ℃培养12 h。

挑取单菌落接种于5 mL含有Amp(100 mg/mL)的液体LB培养基中，37 ℃，180 r/min培养12 h。提取载体使用BamHⅠ/EcoRⅠ进行双酶切鉴定并利用通用引物3′-AOX1Primer、5′-AOX1Primer进行PCR鉴定，筛选出阳性重组表达载体。

1.3.3 重组表达载体pHIL-S1-3pBD1的酵母电击转化 线性化重组表达载体pHIL-S1-3pBD1，反应体系为：SalⅠ1 μL，10×L Buffer 2 μL，重组载体4 μg，加ddH2O至20 μL。37 ℃酶切12 h，4 ℃终止酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测，以线性化的空pHIL-S1作对照。

制备GS115酵母感受态细胞，取毕赤酵母GS115菌种划线接种于YPD平板上，30 ℃过夜培养。挑取单菌落接种于5 mL YPD培养液中，30 ℃，250 r/min培养12 h。加0.5 mL上述毕赤酵母菌液到50 mL新鲜培养基中，30 ℃，250 r/min培养至OD600值达0.8～1。以下步骤在冰上操作：取50 mL菌液于预冷的50 mL离心管中，1 500 g，4 ℃，离心5 min，弃去上清。加50 mL冰水于沉淀菌中，重新悬浮，1 500 g，4 ℃，离心5 min，弃去上清。加25 mL冰水于沉淀菌中，重新悬浮，1 500 g，4 ℃，离心5 min，弃去上清。加2 mL预冷1 mol/L山梨醇于沉淀中，重新悬浮，1 500 g，4 ℃，离心5 min，弃去上清，加0.1 mL冰水于沉淀菌中，重新悬浮，立即使用。

电转化重组表达载体pHIL-S1-3pBD1，取20 μL线性化重组载体加入80 μL酵母感受态细胞，立即放入0.2 cm冰电转杯中。冰浴5 min。依照电转仪说明书，以电容25 μF、电压1.5 kV、电阻200 Ω 进行电击，电击结束后立即加1 mL 1 mol/L的冰浴山梨醇于电转杯中，并将其转移到无菌的1.5 mL离心管中。取200 μL涂布于MD板。30 ℃静置60 min，待液体全部吸收后，倒置培养3 d，直到转化子出现。同时取空载体pHIL-S1作相同处理，用于构建背景对照菌株。

按照北京索莱宝科技有限公司基因组提取试剂盒说明书提取重组酵母基因组。以基因组为模板，用pHIL-S1载体测序引物5′AOX1 Primer和3′AOX1 Primer进行PCR反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测，送往TaKaRa测序。

对重组转化子进行Mut表型鉴定。把涂布到MD平板上生长出来的酵母单菌落挑出，采用针点接种的方式将同一阳性菌落分别接种于MM平板和MD平板，尽量控制接种菌量一致，且接种时不要涂布，用针尖点种，保证接种面积相同，30 ℃倒置培养3 d，根据菌落的大小与生长速度判断转化子的表型。在MM平板与MD平板上均能正常生长且菌落大小相当的转化子为Mut+表型；在MD平板上生长正常，在MM平板上几乎不能生长或生长很缓慢，则为Muts表型。

1.3.4 重组毕赤酵母的诱导表达 将筛选出的Mut+型阳性重组表达菌株接种于25 mL BMGY培养基中，30 ℃，250 r/min振摇至OD600值达到2～6时，室温3 000 r/min离心5 min收集菌体；用5 mL的BMMY重悬菌体传于200 mL BMMY培养基中，30 ℃，250 r/min振摇。于培养24、48、72和96 h时补加甲醇至终浓度0.5%。同时以空载体转化的宿主菌作对照。诱导培养96 h后4 000 r/min 离心10 min收集培养上清液，真空冻干后进行SDS-PAGE检测。

2 结果

2.1 目的基因3pBD1的获取 利用EcoRⅠ和BamHⅠ对pUC57-3pBD1进行双酶切，凝胶电泳检测625 bp处有清晰条带(图1)，与设计的目的基因3pBD1大小一致，割胶回收纯化获得3pBD1基因。

图1 EcoRⅠ和BamHⅠ 酶切pUC57-3pBD1琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of pUC57-3pBD1 restriction digestion by EcoR Ⅰ and BamH ⅠM：DL-2 000分子量标记；1～3：酶切产物M：DL-2 000 Marker;1～3：Restriction digested products

2.2 重组表达载体pHLI-S1-3pBD1的鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果显示(图2)：重组载体pHIL-S1-3pBD1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，在8.3 kb和625 bp处各有1条清晰的电泳条带，表达载体pHIL-S1无625 bp的条带，证明3pBD1基因已经连接至pHIL-S1。

图2 pHIL-S1-3pBD1酶切琼脂糖凝胶分析Fig.2 Restrictive endonuclease mapping of pHIL-S1-3pBD1M1：分子量标记；M2:DL-2 000 Marker;1～3：重组载体的EcoRⅠ/BamHⅠ 双酶切;4：提取重组载体/未酶切M1：Molecular weight marker；M2：DL-2 000 Marker;1～3：Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant vector digested with EcoR Ⅰ/BamHⅠ；4：Extract of recombinant vector/undigest

2.3 重组酵母的鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果显示(图3)：重组酵母菌的基因组经PCR扩增后，在850 bp处有1条清晰的电泳条带，空载体和空酵母菌无850 bp的条带，证明重组载体pHIL-S1-3pBD1构建正确并成功导入毕赤酵母中。并且重组酵母PCR产物测序结果与人工设计的3pBD1基因序列同源性为99%，进一步充分说明重组载体pHIL-S1-3pBD1构建正确并成功导入毕赤酵母中。

图3 重组酵母PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳分析Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of GS1115/pHLI-S1-3pBD1M：DL-2 000分子量标记；1：空穿梭载体PCR；2：重组酵母PCR产物；3：空酵母菌PCRM：DL-2 000 Marker；1：PRC production of pHLI-S1;2：PRC production of GS1115/pHLI-S1-3pBD1；3：PRC production of GS1115/pHLI-S1

2.4 阳性转化子的Mut表型鉴定 Mut表型鉴定显示(图4)：获得的重组酵母菌株在MM平板与MD平板上均能正常生长且菌落大小相当，为Mut+表型。

图4 阳性转化子的表型鉴定Fig.4 Identification of mutphenotype of the positive transformants

2.5 表达产物的SDS-PAGE电泳 SDS-PAGE检测结果显示(图5)：重组酵母菌株经甲醇诱导表达后，在22 kDa处有1条清晰的特异条带，含有空载体pHIL-S1的酵母菌株在22 kDa处无条带，证明3pBD1基因在毕赤酵母酵母中得到了表达。

图5 3pBD1表达上清SDS-PAGE结果Fig.5 SDS-PAGE results of culture supernatant of 3pBD1M：蛋白分子量标记；1～2：GS1115/pHLI-S1；3～9：96 h的表达上清浓缩后产物M：Molecular weight markers for protein；1～2：GS1115/pHLI-S1；3～9：Concentrated sample of 96 hours respectively

3 讨论

毕赤酵母表达系统具有独特的优势[14-15]，作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行正确的加工折叠和翻译后修饰、外源基因通过载体整合到毕赤酵母基因组上，得到菌株比较稳定、外源蛋白既可存在于胞内又可分泌到胞外、生长速度快、表达量高、培养成本低、糖基化程度低、背景蛋白少，毕赤酵母作为外源蛋白表达系统投放市场以来，经历了许多科研工作者的改进和优化，有极大的应用前景[16]。

防御素是一类对抗外源病原体入侵的肽类物质,是动物自身免疫防御系统的重要组成部分[17]。由于天然抗菌肽在生物体内的含量低,并且体外抑菌效果有限，本试验将串联技术与融合表达技术结合起来，根据酵母密码子偏好性设计了pBD1的三倍串联体3pBD1基因，适当增加拷贝数，提高目的蛋白的表达效率，且各肽段间加入肠激酶切割位点(DDDDK)以获得活性蛋白质单体，与分泌型真核表达载体pHLI-S1连接构建重组表达载体pHIL-S1-3pBD1，SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母宿主菌GS115，对重组转化子进行Mut表型鉴定，筛选得到Mut﹢表型进行甲醇诱导表达，实现了小分子多肽在体外的高效表达。

本试验选用的受体菌是Cregg建立的GS115。其表型为His-Mut+，其染色体基因组中HIS4(编码组氨酸脱氢酶的基因)发生了突变，因而不能合成组氨醇脱氢酶，只能在含有组氨酸的培养基中生长。载体pHLI-S1含有与GS115染色体DNA同源的乙醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX1)序列和完整的HIS4基因，通过同源序列的介导，两者可以发生同源重组，HIS4处的突变被修复，重组菌株可以自行合成组氨醇脱氢酶，故可在组氨酸缺陷的MD培养基上筛选。AOX1是甲醇代谢途径的第1个限速酶，AOX1基因的启动子是甲醇诱导型强启动子，常用于表达外源基因[18]。当SalⅠ线性化的重组载体pHIL-S1-3pBD1转化宿主菌GS115时，理论上一般在HIS4基因位点进行整合，此时由于AOX1的存在，得到的转化子原则上都是Mut+，它可以在以甲醇为唯一碳源的MM培养基上正常生长。但由于线性化的重组载体也有可能在AOX1位点发生整合，当在该位点整合时AOX1基因就会因外源基因的插入而失活或被外源基因替换，此时酵母染色体上虽然存在与AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作为碳源的能力远远低于AOX1，这样转化子在以甲醇为唯一碳源的MM培养基上生长十分缓慢，即表现为Muts。本试验中所有的阳性转化子均为Mut+型。将Mut+型阳性重组表达菌株经BMGY和BMMY培养基培养，甲醇诱导表达96 h后，经SDS-PAGE检测，在22 kDa处得到1条特异性条带，而在含空载体的GS115对照处没有条带，初步证明3pBD1基因在毕赤酵表达系统中得到了表达，为后期培养表达条件的优化和大规模生产提供了科学依据。