蓝舌病病毒血清8型NS3蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达与鉴定
2020-09-29黄超华曹琛福阮周曦史卫军林彦星曾少灵刘建利陈金顶花群义
黄超华,曹琛福,阮周曦,史卫军,林彦星,曾少灵,刘建利,王 潇,陈金顶,花群义
(1.华南农业大学兽医学院,广东 广州 510642;2.深圳海关动植物检验检疫技术中心,广东 深圳 518045)
蓝舌病(Bluetongue,BT)是一种感染包括山羊、牛、绵羊及野生反刍动物的虫媒性传染病,其病原为蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV),主要通过雌性库蠓叮咬进行传播[1]。BT的流行和暴发会带来巨大的经济损失,包括感染动物大批死亡和被扑杀等直接损失,以及疫病监测、动物免疫、畜产品出口受限的间接损失,为此加强BT的预防和控制对畜牧业发展至关重要[2-3]。
BTV在分类学上属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的蓝舌病病毒亚群,目前已发现并确认共有31个血清型。BTV基因组可编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。NS3蛋白是BTV的一种非结构蛋白,由BTVS10编码而成,其氨基酸序列及核苷酸序列均高度保守,具有群抗原特异性。研究者发现,NS3蛋白作为BTV唯一的糖蛋白,具有类似病毒孔蛋白的功能,参与成熟的BTV粒子从宿主细胞的释放过程[4-6]。同时,NS3在哺乳动物细胞中的表达水平远远低于昆虫细胞中;自然感染的动物与灭活疫苗接种的动物体内针对NS3的抗体水平也存在较为显著的差异,可作为一种区分自然感染和疫苗接种的鉴别诊断抗原[7-9]。本试验利用昆虫杆状病毒系统表达蓝舌病病毒8型NS3蛋白,并通过间接免疫荧光、Western Blot和间接ELISA等手段对其反应原性进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 菌株、血清和细胞 pFastBac-HTA质粒为Invitrogen公司产品;BTV绵羊阳性血清、兔抗蓝舌病病毒NS3蛋白(原核表达)多抗和昆虫细胞Sf9均由本实验室保存。
1.2 主要试剂 Cellfectin®II Reagent、SF-900Ⅲ培养基、PureLinkTMHiPure质粒纯化试剂盒,均为Invitrogen公司产品;限制性内切酶以及Taq酶、感受态细胞DH5α,均为TaKaRa公司产品;所使用的抗体均为Abcam公司产品;TMB显色试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。
1.3 基因合成 以参考基因 BTV8S10 AM498060.1为模板,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,BTVNS3整个开放阅读框(ORF),获得重组质粒pUC-BTV8-NS3,其中NS3全长约703 bp,并在上下游分别引入BamH I、EcoR I 两个酶切位点。合成引物:上游引物(BamH I):5′-GGATCCGATGCTATCCGGGCTGATCC-3′;下游引物(EcoR I):5′-GAATTCTCAGGTTAATGGCATTTCGA-3′;M13上下游引物见Invitrogen公司Bac-to-Bac®TOPO®Expression System User Manual。
1.4 重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3的构建 按照常规的分子克隆技术,即双酶切、T4连接、转化、菌落PCR和双酶切鉴定等方法,将BTV8NS3 序列插入至pFastBac-HTA获得重组质粒pFastBac-HTA-NS3;通过热转化的方式将重组质粒pFastBac-HTA-NS3转化入感受态细胞DH10Bac中,蓝白斑筛选。挑取单个白色菌落,进行菌落PCR鉴定,确定NS3是否转座成功。鉴定结果为阳性的菌落过夜大量培养,并用PureLinkTMHiPure质粒纯化试剂盒大量提取纯化重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3。
1.5 重组杆状病毒rBac-NS3的获得 用转染试剂盒Cellfectin®Ⅱ Reagent将重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3转染Sf9细胞,设空白对照,持续观察细胞病变情况。在细胞病变明显时,收集细胞培养上清,即P1代重组杆状病毒rBac-NS3,并继续传代以提高重组杆状病毒的滴度。
1.6 NS3蛋白的表达与纯化 将无血清培养的Sf9细胞转瓶至75 cm2细胞培养瓶中(70%~80%)。贴壁1 h后,接入适量的重组杆状病毒rBac-NS3,72 h收集细胞、充分裂解并离心收集细胞裂解上清。大量收集细胞裂解上清。使用Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒纯化重组NS3蛋白。
1.7 间接免疫荧光试验 将Sf9细胞接种至24孔培养板中,贴壁1 h后,接种重组杆状病毒rBac-NS3,28 ℃培养72 h。弃去培养液,PBST洗涤后,加入预冷的4%多聚甲醛,室温固定1 h;PBST洗涤后,加入1% Triton X-100,室温通透1 h;洗涤后,加入封闭液室温封闭2 h;弃封闭液,加入兔抗蓝舌病病毒NS3蛋白(原核表达)多抗,4 ℃孵育过夜;洗涤后,加入Goat Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)(1∶200稀释),37 ℃避光孵育30 min;洗涤后,倒置荧光显微镜下观察。
1.8 SDS-PAGE和Western Blot检测 通过SDS-PAGE和Western Blot方法确认NS3蛋白的纯化效果和反应原性。按照常规步骤进行SDS-PAGE电泳和转膜。转膜后,分别以Anti-His单抗(1∶5 000稀释)和绵羊BTV阳性血清(1∶500稀释)为一抗,以Rabbit Anti-Mouse IgG H&L(HRP)(1∶5 000)和Rabbit Anti-SheepIgG H&L(HRP)(1∶5 000)为二抗,进行Western Blot。
1.9 间接ELISA方法验证NS3蛋白的反应原性 为进一步验证重组蛋白NS3的反应原性,以纯化的蛋白NS3为包被蛋白,建立一种间接ELISA。并以该间接ELISA方法检测已知的BTV阳性血清20份和阴性血清20份。
2 结果
2.1 重组杆状病毒质粒 Bacmid-NS3的构建:通过亚克隆,将NS3序列插入至载体pFastBac-HTA,构建重组质粒pFastBac-HTA-NS3,并以双酶切和菌落PCR进行鉴定,鉴定结果见图1,PCR和双酶切均能得到700 bp左右的目的条带,与预期结果一致。同时,经全基因测序,确认NS3序列完整、无碱基突变、且与载体上His标签处于同一ORF中。将测序正确的重组质粒pFastBac-HTA-NS3转化入DH10Bac,通过蓝白斑、菌落PCR进行筛选。以M13引物和NS3特异性引物进行PCR鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3,结果与预期一致。
图1 pFastBac-HTA-NS3鉴定Fig.1 Identification of pFastBac-HTA-NS31:菌落PCR鉴定;2:酶切鉴定;M:DNA Marker (DL-5 000)1:Colony PCR;2:Double digests;M:DNA Marker (DL-5 000)
2.2 重组杆状病毒rBac-NS3的获得 转染试剂盒将Bacmid-NS3转染Sf9细胞。转染后48~72 h可以观察到明显的细胞病变:与正常Sf9细胞相比,细胞数量明显变少,细胞变大且发生臌胀、变得容易脱落,并有少量细胞破碎,见中插彩版图2。转染后超过72 h,Sf9细胞大量破碎。
2.3 间接免疫荧光试验 通过间接免疫荧光检测重组杆状病毒rBac-NS3感染Sf9细胞后NS3蛋白的表达情况。结果见中插彩版图3,野生杆状病毒(未插入目的基因)感染的Sf9细胞未观察到任何特异性的绿色荧光,而重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞显示出强烈的绿色荧光。这一结果表明,重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞能够大量表达NS3蛋白。
2.4 NS3蛋白的SDS-PAGE与Western Blot分析 大量接毒Sf9细胞,72 h后收集细胞裂解上清。使用Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒纯化重组NS3蛋白。取少量纯化产物和细胞裂解上清,进行SDS-PAGE和Western Blot分析。分别用Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清进行Western Blot分析,见图4。结果显示,在重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞蛋白中,分别以Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清作为一抗,均可以检测到大小约为28.5 kDa的特异性蛋白条带,与预期NS3蛋白大小一致,而在野生杆状病毒感染的Sf9细胞对照并无此条带。这一结果进一步确认了重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞可表达BTV NS3蛋白。Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒的纯化产物的SDS-PAGE结果显示(图5),在28.5 kDa左右有1条明显的蛋白条带,与预期的NS3蛋白大小(含His标签)一致。与此同时,分别以Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清作为一抗的Western Blot结果显示,在同样的位置检测到明显的蛋白条带。这些结果表明,本试验成功地纯化到具有反应原性的BTV NS3蛋白。
图4 NS3蛋白纯化Western Blot结果Fig.4 Western Blot result of NS3 proteinA:Anti-His单抗Western Blot结果;B:绵羊蓝舌病阳性血清Western Blot结果;M:蛋白Marker;1:野生杆状病毒感染的Sf9细胞对照;2:重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞;3:纯化的NS3蛋白A:Western Blot with Anti-His McAb;B:Western Blot with BTV positive serum;M:Protein marker;1:Sf9 cells infected with wild baculovirus;2:Sf9 cells infected with rBac-NS3;3:The purified of NS3 protein
图5 NS3蛋白表达纯化SDS-PAGE结果Fig.5 SDS-PAGE result of NS3 protein1:NS3蛋白纯化结果;2:重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞;3:野生杆状病毒感染的Sf9细胞对照;M:蛋白Marker1:The purified of NS3 protein;2:Sf9 cells infected with rBac-NS3;3:Sf9 cells infected with wild baculovirus;M:Protein Marker
2.5 间接ELISA方法验证NS3蛋白的免疫原性 为进一步验证重组蛋白NS3的免疫原性,以纯化的蛋白NS3为包被蛋白,初步建立一种间接ELISA,检测已知的20份蓝舌病阳性血清和20份蓝舌病阴性血清。结果显示,20份蓝舌病阳性血清OD值均大于1.5,而20份蓝舌病阴性血清OD值在0.3左右,两者差异显著,如图6所示。这一结果表明,以纯化的蛋白NS3为包被蛋白的间接ELISA可区分蓝舌病阳性血清和阴性血清,进一步验证了本试验纯化获得的重组蛋白NS3具有良好反应原性。
图6 间接ELISA结果Fig.6 The result of indirect-ELISA
3 讨论
蓝舌病作为一种反刍动物疫病,可给流行国家或地区带来重大的经济损失。随着全球气候变暖,虫媒活动范围扩大,BT的流行范围也不断扩大。我国于1979年在云南发现并分离到BTV。迄今为止,我国共有31个省市地区发现此病,存在的血清型众多,其中主要流行的血清型为1型和16型。鉴于其重大危害,预防和控制BT成为了世界各国重大动物疫病研究的热点。
与原核表达系统相比,昆虫杆状病毒表达系统能够识别和处理信号肽,并且能够在翻译后实现如糖基化、酰化、磷酸化和二硫键的形成等修饰,从而确保目的蛋白结构与功能的完整性[10-11]。同时考虑到BTV属于虫媒病毒,可在昆虫细胞中复制,并且NS3蛋白本身在昆虫细胞中的表达水平远远高于哺乳动物细胞。为此,本试验选用昆虫杆状病毒表达系统对NS3进行表达,以期获得具有天然结构和功能的NS3蛋白。本试验用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统实现BTV8 NS3蛋白的可溶表达,并利用His标签成功纯化到NS3蛋白。本试验通过间接免疫荧光检测到,感染了重组杆状病毒rBac-NS3的Sf9细胞可以大量表达NS3蛋白;SDS-PAGE结果、分别以Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清作为一抗的Western Blot结果均表明,本试验成功纯化到了具有免疫活性的NS3蛋白;以纯化的蛋白为包被抗原初步建立的间接ELISA方法,可明显区分BTV阳性血清和阴性血清,进一步说明本试验纯化的NS3蛋白具有良好的反应活性。
BTV NS3蛋白可作为一种诊断抗原用于鉴别诊断蓝舌病野毒感染和疫苗接种[12]。而且,随着研究的不断深入,人们对NS3蛋白功能的认识不断更新。研究者发现,NS3蛋白可以通过MAPK/ERK通路影响病毒的复制,其2个多碱基元件(Polybasic motifs)在BTV的突变和病毒粒子释放中有着关键作用,细小的改变均会影响病毒的扩增和扩散[13-16]。本试验利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,实现了BTV8 NS3蛋白的可溶表达,并利用His标签成功纯化到具有良好的反应原性的NS3蛋白,为BTV NS3蛋白功能的进一步研究以及鉴别诊断试剂盒的研制提供理论基础。