蓝舌病病毒血清8型NS3蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达与鉴定

黄超华，曹琛福，阮周曦，史卫军，林彦星，曾少灵，刘建利，王 潇，陈金顶，花群义

(1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045)

蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种感染包括山羊、牛、绵羊及野生反刍动物的虫媒性传染病，其病原为蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)，主要通过雌性库蠓叮咬进行传播[1]。BT的流行和暴发会带来巨大的经济损失，包括感染动物大批死亡和被扑杀等直接损失，以及疫病监测、动物免疫、畜产品出口受限的间接损失，为此加强BT的预防和控制对畜牧业发展至关重要[2-3]。

BTV在分类学上属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的蓝舌病病毒亚群，目前已发现并确认共有31个血清型。BTV基因组可编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。NS3蛋白是BTV的一种非结构蛋白，由BTVS10编码而成，其氨基酸序列及核苷酸序列均高度保守，具有群抗原特异性。研究者发现，NS3蛋白作为BTV唯一的糖蛋白，具有类似病毒孔蛋白的功能，参与成熟的BTV粒子从宿主细胞的释放过程[4-6]。同时，NS3在哺乳动物细胞中的表达水平远远低于昆虫细胞中；自然感染的动物与灭活疫苗接种的动物体内针对NS3的抗体水平也存在较为显著的差异，可作为一种区分自然感染和疫苗接种的鉴别诊断抗原[7-9]。本试验利用昆虫杆状病毒系统表达蓝舌病病毒8型NS3蛋白，并通过间接免疫荧光、Western Blot和间接ELISA等手段对其反应原性进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌株、血清和细胞 pFastBac-HTA质粒为Invitrogen公司产品；BTV绵羊阳性血清、兔抗蓝舌病病毒NS3蛋白(原核表达)多抗和昆虫细胞Sf9均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 Cellfectin®II Reagent、SF-900Ⅲ培养基、PureLinkTMHiPure质粒纯化试剂盒，均为Invitrogen公司产品；限制性内切酶以及Taq酶、感受态细胞DH5α，均为TaKaRa公司产品；所使用的抗体均为Abcam公司产品；TMB显色试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.3 基因合成 以参考基因 BTV8S10 AM498060.1为模板，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，BTVNS3整个开放阅读框(ORF)，获得重组质粒pUC-BTV8-NS3，其中NS3全长约703 bp，并在上下游分别引入BamH I、EcoR I 两个酶切位点。合成引物：上游引物(BamH I)：5′-GGATCCGATGCTATCCGGGCTGATCC-3′；下游引物(EcoR I)：5′-GAATTCTCAGGTTAATGGCATTTCGA-3′；M13上下游引物见Invitrogen公司Bac-to-Bac®TOPO®Expression System User Manual。

1.4 重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3的构建 按照常规的分子克隆技术，即双酶切、T4连接、转化、菌落PCR和双酶切鉴定等方法，将BTV8NS3 序列插入至pFastBac-HTA获得重组质粒pFastBac-HTA-NS3；通过热转化的方式将重组质粒pFastBac-HTA-NS3转化入感受态细胞DH10Bac中，蓝白斑筛选。挑取单个白色菌落，进行菌落PCR鉴定，确定NS3是否转座成功。鉴定结果为阳性的菌落过夜大量培养，并用PureLinkTMHiPure质粒纯化试剂盒大量提取纯化重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3。

1.5 重组杆状病毒rBac-NS3的获得 用转染试剂盒Cellfectin®Ⅱ Reagent将重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3转染Sf9细胞，设空白对照，持续观察细胞病变情况。在细胞病变明显时，收集细胞培养上清，即P1代重组杆状病毒rBac-NS3，并继续传代以提高重组杆状病毒的滴度。

1.6 NS3蛋白的表达与纯化 将无血清培养的Sf9细胞转瓶至75 cm2细胞培养瓶中(70%～80%)。贴壁1 h后，接入适量的重组杆状病毒rBac-NS3，72 h收集细胞、充分裂解并离心收集细胞裂解上清。大量收集细胞裂解上清。使用Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒纯化重组NS3蛋白。

1.7 间接免疫荧光试验 将Sf9细胞接种至24孔培养板中，贴壁1 h后，接种重组杆状病毒rBac-NS3，28 ℃培养72 h。弃去培养液，PBST洗涤后，加入预冷的4%多聚甲醛，室温固定1 h；PBST洗涤后，加入1% Triton X-100，室温通透1 h；洗涤后，加入封闭液室温封闭2 h；弃封闭液，加入兔抗蓝舌病病毒NS3蛋白(原核表达)多抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后，加入Goat Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)(1∶200稀释)，37 ℃避光孵育30 min；洗涤后，倒置荧光显微镜下观察。

1.8 SDS-PAGE和Western Blot检测 通过SDS-PAGE和Western Blot方法确认NS3蛋白的纯化效果和反应原性。按照常规步骤进行SDS-PAGE电泳和转膜。转膜后，分别以Anti-His单抗(1∶5 000稀释)和绵羊BTV阳性血清(1∶500稀释)为一抗，以Rabbit Anti-Mouse IgG H&L(HRP)(1∶5 000)和Rabbit Anti-SheepIgG H&L(HRP)(1∶5 000)为二抗，进行Western Blot。

1.9 间接ELISA方法验证NS3蛋白的反应原性 为进一步验证重组蛋白NS3的反应原性，以纯化的蛋白NS3为包被蛋白，建立一种间接ELISA。并以该间接ELISA方法检测已知的BTV阳性血清20份和阴性血清20份。

2 结果

2.1 重组杆状病毒质粒 Bacmid-NS3的构建：通过亚克隆，将NS3序列插入至载体pFastBac-HTA，构建重组质粒pFastBac-HTA-NS3，并以双酶切和菌落PCR进行鉴定，鉴定结果见图1，PCR和双酶切均能得到700 bp左右的目的条带，与预期结果一致。同时，经全基因测序，确认NS3序列完整、无碱基突变、且与载体上His标签处于同一ORF中。将测序正确的重组质粒pFastBac-HTA-NS3转化入DH10Bac，通过蓝白斑、菌落PCR进行筛选。以M13引物和NS3特异性引物进行PCR鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-NS3，结果与预期一致。

图1 pFastBac-HTA-NS3鉴定Fig.1 Identification of pFastBac-HTA-NS31：菌落PCR鉴定；2：酶切鉴定；M：DNA Marker (DL-5 000)1:Colony PCR;2:Double digests;M:DNA Marker (DL-5 000)

2.2 重组杆状病毒rBac-NS3的获得 转染试剂盒将Bacmid-NS3转染Sf9细胞。转染后48～72 h可以观察到明显的细胞病变：与正常Sf9细胞相比，细胞数量明显变少，细胞变大且发生臌胀、变得容易脱落，并有少量细胞破碎，见中插彩版图2。转染后超过72 h，Sf9细胞大量破碎。

2.3 间接免疫荧光试验 通过间接免疫荧光检测重组杆状病毒rBac-NS3感染Sf9细胞后NS3蛋白的表达情况。结果见中插彩版图3，野生杆状病毒(未插入目的基因)感染的Sf9细胞未观察到任何特异性的绿色荧光，而重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞显示出强烈的绿色荧光。这一结果表明，重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞能够大量表达NS3蛋白。

2.4 NS3蛋白的SDS-PAGE与Western Blot分析 大量接毒Sf9细胞，72 h后收集细胞裂解上清。使用Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒纯化重组NS3蛋白。取少量纯化产物和细胞裂解上清，进行SDS-PAGE和Western Blot分析。分别用Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清进行Western Blot分析，见图4。结果显示，在重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞蛋白中，分别以Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清作为一抗，均可以检测到大小约为28.5 kDa的特异性蛋白条带，与预期NS3蛋白大小一致，而在野生杆状病毒感染的Sf9细胞对照并无此条带。这一结果进一步确认了重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞可表达BTV NS3蛋白。Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒的纯化产物的SDS-PAGE结果显示(图5)，在28.5 kDa左右有1条明显的蛋白条带，与预期的NS3蛋白大小(含His标签)一致。与此同时，分别以Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清作为一抗的Western Blot结果显示，在同样的位置检测到明显的蛋白条带。这些结果表明，本试验成功地纯化到具有反应原性的BTV NS3蛋白。

图4 NS3蛋白纯化Western Blot结果Fig.4 Western Blot result of NS3 proteinA：Anti-His单抗Western Blot结果；B：绵羊蓝舌病阳性血清Western Blot结果；M：蛋白Marker；1：野生杆状病毒感染的Sf9细胞对照；2：重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞；3：纯化的NS3蛋白A:Western Blot with Anti-His McAb;B:Western Blot with BTV positive serum;M:Protein marker;1:Sf9 cells infected with wild baculovirus;2:Sf9 cells infected with rBac-NS3;3:The purified of NS3 protein

图5 NS3蛋白表达纯化SDS-PAGE结果Fig.5 SDS-PAGE result of NS3 protein1：NS3蛋白纯化结果；2：重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞；3：野生杆状病毒感染的Sf9细胞对照；M：蛋白Marker1:The purified of NS3 protein;2:Sf9 cells infected with rBac-NS3;3:Sf9 cells infected with wild baculovirus;M:Protein Marker

2.5 间接ELISA方法验证NS3蛋白的免疫原性 为进一步验证重组蛋白NS3的免疫原性，以纯化的蛋白NS3为包被蛋白，初步建立一种间接ELISA，检测已知的20份蓝舌病阳性血清和20份蓝舌病阴性血清。结果显示，20份蓝舌病阳性血清OD值均大于1.5，而20份蓝舌病阴性血清OD值在0.3左右，两者差异显著，如图6所示。这一结果表明，以纯化的蛋白NS3为包被蛋白的间接ELISA可区分蓝舌病阳性血清和阴性血清，进一步验证了本试验纯化获得的重组蛋白NS3具有良好反应原性。

图6 间接ELISA结果Fig.6 The result of indirect-ELISA

3 讨论

蓝舌病作为一种反刍动物疫病，可给流行国家或地区带来重大的经济损失。随着全球气候变暖，虫媒活动范围扩大，BT的流行范围也不断扩大。我国于1979年在云南发现并分离到BTV。迄今为止，我国共有31个省市地区发现此病，存在的血清型众多，其中主要流行的血清型为1型和16型。鉴于其重大危害，预防和控制BT成为了世界各国重大动物疫病研究的热点。

与原核表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统能够识别和处理信号肽，并且能够在翻译后实现如糖基化、酰化、磷酸化和二硫键的形成等修饰，从而确保目的蛋白结构与功能的完整性[10-11]。同时考虑到BTV属于虫媒病毒，可在昆虫细胞中复制，并且NS3蛋白本身在昆虫细胞中的表达水平远远高于哺乳动物细胞。为此，本试验选用昆虫杆状病毒表达系统对NS3进行表达，以期获得具有天然结构和功能的NS3蛋白。本试验用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统实现BTV8 NS3蛋白的可溶表达，并利用His标签成功纯化到NS3蛋白。本试验通过间接免疫荧光检测到，感染了重组杆状病毒rBac-NS3的Sf9细胞可以大量表达NS3蛋白；SDS-PAGE结果、分别以Anti-His单抗和BTV绵羊阳性血清作为一抗的Western Blot结果均表明，本试验成功纯化到了具有免疫活性的NS3蛋白；以纯化的蛋白为包被抗原初步建立的间接ELISA方法，可明显区分BTV阳性血清和阴性血清，进一步说明本试验纯化的NS3蛋白具有良好的反应活性。

BTV NS3蛋白可作为一种诊断抗原用于鉴别诊断蓝舌病野毒感染和疫苗接种[12]。而且，随着研究的不断深入，人们对NS3蛋白功能的认识不断更新。研究者发现，NS3蛋白可以通过MAPK/ERK通路影响病毒的复制，其2个多碱基元件(Polybasic motifs)在BTV的突变和病毒粒子释放中有着关键作用，细小的改变均会影响病毒的扩增和扩散[13-16]。本试验利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，实现了BTV8 NS3蛋白的可溶表达，并利用His标签成功纯化到具有良好的反应原性的NS3蛋白，为BTV NS3蛋白功能的进一步研究以及鉴别诊断试剂盒的研制提供理论基础。