禽多杀性巴氏杆菌菌影活体免疫效果评价

2020-09-29仇薪鑫闫红军

中国兽医杂志 2020年4期

李龙，仇薪鑫，闫红军

(杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100)

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起的家禽出血性白血病[1]，由于多重耐药菌的出现，造成抗生素使用效果受限[2]，因此疫苗仍是该病的主要防控手段。目前市场上出售的疫苗多为单一或多个血清型多杀性巴氏杆菌灭活苗或弱毒苗，但灭活疫苗和弱毒疫苗存在免疫原性弱、风险大和贮存运输不便等缺点，限制了它们的发展与应用[3]。细菌菌影是一种不含核酸、胞浆等物质的细菌空壳[4]。菌影既兼有活菌的天然形态和免疫原性，同时又兼有灭活菌的高效安全性。目前已报道的菌影主要通过裂解基因和化学试剂2种方法制备，通过处理在细胞壁上形成裂解通道或小孔，促使细菌内容物释放，细菌死亡[5-7]，其中化学法相比于基因裂解法更简单、高效和安全[8]。前期我们利用化学法成功制备出禽多杀性巴氏杆菌菌影(已接受，待刊)，但其在活体中的使用效果还不清楚，因此本试验拟通过皮下注射、静脉注射和口服3种方式接种，在蛋鸡上对禽多杀性巴氏杆菌菌影免疫效果进行活体评价，为菌影应用于家禽多杀性巴氏杆菌病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择80只12周龄健康的海兰灰母鸡，饲养温度21～27 ℃，整个饲养期内鸡只自由采食和饮水。

1.2 免疫和攻毒将鸡只随机分为4组，分别命名为A、B、C组和D组，每组20只，A组鸡只皮下注射0.5 mL灭菌PBS，B、C组和D组鸡只分别通过口服、皮下注射和静脉注射3种方式免疫接种0.5 mL制备好的巴氏杆菌菌影(P.multocidaghosts，PMGs)，接种量为2×106菌影细胞/mL，鸡只免疫2次，一免在饲养1周时，二免在饲养3周时，免疫间隔为2周。在二免后2周所有鸡只通过静脉注射攻毒禽多杀性巴氏杆菌菌株(CVCC474，购自中国兽医药品监察所)，攻毒量为2×108CFU。攻毒后2周统计鸡只死亡率，每次免疫后2周和攻毒后2周鸡只翅静脉采血备用。

1.3 IgG浓度测定为了测定菌影免疫下鸡只体液免疫情况，分别在一免前和二免后分离鸡血清，利用鸡IgG ELISA试剂盒(ZY-IgG-Ch，上海泽叶生物科技有限公司)测定鸡只血清中的IgG浓度，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 流式细胞仪分析为了测定菌影免疫下鸡只细胞免疫情况，在二免2周后鸡只翅静脉抗凝采血，加入PBS(pH值=7.4)将抗凝血进行1∶1稀释，稀释全血355 g离心20 min，用毛细管缓慢收集外周血白细胞，无菌PBS洗脱3次，分离的外周血白细胞利用FITC标记的鸡CD4+和CD8+单克隆抗体染色后利用流式细胞仪(美国BD)上机检测，根据荧光活化细胞分检器(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)分析，统计出CD4+和CD8+所占的百分含量。

1.5 血清抗菌能力测定参照Vinod N等[8](2015年)推荐的方法进行。将100 mL巴氏杆菌菌悬液(1×106CFU/mL)加入25 mL血清中，室温静置1 h将涂板进行细菌计数，以灭菌的PBS处理作为对照，利用公式计算血清抗菌力，血清抗菌力=[1-(血清处理后细菌数量/PBS处理细菌数量)]×100%。

1.6 巴氏杆菌计数在攻毒后2周，每组随机选择8只鸡屠宰，无菌取出肝脏、肺脏、脾脏和肾脏，称重后加入5 mL灭菌PBS，匀浆处理，10倍梯度稀释，取稀释液100 μL均匀涂板计数。

1.7 数据统计试验数据利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，利用LSD post-hoc进行多重比较，试验结果采用平均值±标准差(Mean ±SD)表示，以P<0.05判定结果为差异显著。

2 结果

2.1 体液免疫反应结果见图1。在饲养1周未免疫前，所有组别在血清IgG水平上并无差异(P>0.05)，但在一免和二免后相对于对照组(A组)，菌影免疫组(B、C组和D组)血清IgG水平显著提高(P<0.05)，3个免疫组之间并无显著差异(P>0.05)。而在攻毒后与对照组相比，免疫组血清IgG水平均显著提高(P<0.05)，其中C组IgG抗体水平最高。

图1 PMGs免疫对鸡只IgG抗体水平的影响Fig.1 Effect of PMGs on IgG level on chickens与A组相比差异显著，*:P<0.05;下图同Compare to group A,*：P<0.05.The same as below

2.2 体液免疫反应结果见图2。在二免后2周相比于对照组(A组)，免疫组(B、C组和D组)外周血白细胞中CD4+和CD8+T细胞的百分含量显著提高(P<0.05)，其中C组的CD4+和CD8+T细胞的百分含量最高，而各免疫组(B、C组和D组)之间并无显著差异(P>0.05)。

图2 PMGs免疫对CD4+(A)和CD8+(B) T细胞百分含量的影响Fig.2 Effect of PMGs on CD4+ (A) and CD8+(B) T cells level on chickens

2.3 血清抗菌力结果见图3和图4。在饲养1周未免疫前，所有组别血清抗菌力上并无显著差异，但在一免和二免后2周免疫组(B、C组和D组)相比于对照组(A组)血清抗菌力均显著提高(P<0.05)(图3)。而在鸡只攻毒后，菌影免疫组(B、C组和D组)相比于对照组肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中巴氏杆菌的数量显著降低(P<0.05)，而各免疫组(B、C组和D组)之间并无显著差异(P>0.05)(图4)。

图3 PMGs免疫对血清抗菌力的影响Fig.3 Effect of PMGs on serum bactericidal activities on chickens

图4 PMGs免疫对攻毒后脏器巴氏杆菌负载量的影响Fig.4 Effect of PMGs on bacterial loads in visceral organ on chickens

2.4 保护率结果见表1。在二免后2周，每组鸡只攻毒高致病性多杀性巴氏杆菌2周后，免疫组(B、C组和D组)的保护率为100%，而未免疫组(A组)的保护率只有50%。

表1 攻毒下鸡只的存活率Table 1 The survival of chickens after immunized with Pasteurella multocida

3 讨论

已有研究发现，单一的一种多杀性巴氏杆菌外膜成分还不能够有效的防治禽霍乱的发生，而完整的细胞壁成分在多杀性巴氏杆菌疫苗发挥高效的免疫保护过程中起到重要作用[9]。与其他灭活疫苗相比，菌影疫苗的优势是可以保留完整的病原菌表面抗原，可以作为天然的免疫佐剂[10]。细菌菌影疫苗能够诱导动物机体产生细胞免疫和体液免疫，降低病原菌感染的风险[11-12]。Marandi M V等[13](1997年)报道接种膜蛋白OmpA能显著增加小鼠IgG的分泌，降低多杀性巴氏杆菌感染小鼠的死亡率，提示体液免疫参与了动物体抵抗多杀性巴氏杆菌感染。此外，多杀性巴氏杆菌膜蛋白OmpA同样表现出了良好的免疫原性，能够提高动物体体液免疫水平[14]。在本试验中同样发现，鸡只免疫PMGs后IgG抗体水平显著提高，提示PMGs免疫能够显著提高鸡只体液免疫水平。CD4+T细胞能够促进IgG抗体的分泌和细胞免疫反应，而CD8+T细胞能够破坏入侵到细胞内的病原微生物[15-16]。已有研究表明，多杀性巴氏杆菌中的脂多糖能够诱导机体CD4+和CD8+T细胞的增殖[17]，本试验同样发现，完整细胞外膜结构的PMGs同样能够显著提高鸡只CD4+和CD8+T细胞百分比，诱导CD4+和CD8+T细胞增殖，提高鸡只细胞免疫水平。

集约化养殖模式下家禽饲养量巨大，而传统的免疫方式如注射、刺种、滴眼和滴鼻等造成实际生产中工作量大、鸡只免疫应激强度大等缺陷。而本试验发现，通过皮下注射、静脉注射和口服3种免疫途径，PMGs均能提高鸡只的体液免疫和细胞免疫水平，减少脏器病原菌负载和死亡率，3种免疫方式表现出了相同的免疫效果。Vinod N等[8](2015年)研究同样发现，通过化学法制备的革兰阳性菌金黄色葡萄球菌菌影疫苗通过不同的接种途径下小鼠获得了相同的免疫效果。这些结果提示，PMGs可通过口服的方式接种家禽，简单易行，减少工作量和鸡只应激，在未来的实际推广中有广阔的应用前景。