虾青素对脑出血大鼠的神经保护作用及机制

周子薇，郑晓梅，先耀，涂婷，左清娇

西南医科大学附属医院，四川泸州646000

脑出血是指非外伤性脑实质内出血，具有较高的致残率和病死率。现治疗脑出血的有效药物较少，减轻脑出血继发性的脑损伤是当前研究的热点和难点。脑出血后血肿压迫、脑组织水肿被认为是影响患者恢复的重要原因，而血脑屏障被破坏是导致脑水肿的重要原因[1]。虾青素是海洋生物体内主要的类胡萝卜素，易通过血脑屏障，具有强抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗凋亡、免疫调节等多种生物学活性[2]。因其具备多种生物学活性，又可以通过血脑屏障，因此对帕金森病、阿尔兹海默病等神经系统疾病具有治疗作用。研究发现，虾青素能明显改善脑创伤、脑梗死、脊髓损伤、帕金森病等疾病的神经功能，发挥神经保护作用[3]。目前,关于虾青素对脑出血神经保护作用的报道较少。2018年12月～2019年12月，我们通过构建脑出血大鼠模型，观察虾青素对脑出血大鼠的神经保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠168只，8周龄，体质量180～220 g，购于成都达硕实验动物有限公司。大鼠分笼饲养，自由进食及饮水。饲养室保持清洁通风，相对湿度、温度恒定，全天12 h时间光照。适应性喂养1周后用于实验。

1.1.2 主要试剂与仪器 虾青素购于Macklin公司，分别取4、8 mg虾青素加入2 mL金龙鱼花生油，配置成2、4 mg/mL的混悬液。伊文思蓝(EB)染料购自上海康朗生物科技有限公司，血清炎症因子TNF-α、IL-1β ELISA检测试剂盒购于ELK Biotechnology公司；人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)兔抗大鼠抗体购于CST公司，紧密连接蛋白5(Claudin5)兔抗大鼠抗体购于Bioss公司。普通光学显微镜为日本OLYMPUS产品。

1.2 动物分组与造模 将168只大鼠按照随机数字表法分为模型对照组、低剂量虾青素组、高剂量虾青素组各42只。术前禁食8 h，6%水合氯醛腹腔麻醉，固定于脑立体定位仪上。暴露颅骨前囟及冠状缝，定位右侧尾状核(以前囟为中心，向后0.2 mm，右侧旁开3 mm，深6 mm)，钻孔。模型组从鼠尾静脉取血50 μL，采用“改良二次注血法”注血；假手术组注射等量生理盐水。注射完成后，缓慢拔针并缝合切口[4]。造模2 h后对模型组进行Longa评分[5]，1～3分为造模成功。

1.3 干预方法 低剂量虾青素组、高剂量虾青素组分别给予虾青素20、40 mg/(kg·d)灌胃[6]，假手术组、模型对照组分别给予等体积花生油灌胃，连续7 d。

1.4 神经功能评价 分别于药物干预1、3、7 d，采用Garcia法进行神经功能评分，最高分18分，评分越低表示神经功能障碍越严重[5]。

1.5 血清TNF-α、IL-1β水平检测 于药物干预1、3、7 d，每组分别随机取6只大鼠，采集尾静脉血1 mL，离心取上清液，采用ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β水平，按照试剂盒说明书步骤操作。

1.6 脑组织含水量测定 于药物干预1、3、7 d，每组分别随机取4只大鼠，常规称重、麻醉，断头取脑组织，称取湿重;100 ℃烘烤箱内烘烤24 h，称取干重。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.7 血脑屏障通透性观察 采用EB染色。于药物干预1、3、7 d，每组分别随机取4只大鼠，经尾静脉注射2% EB，3 h后常规称重、麻醉。暴露心脏，固定灌注针，右心耳处剪小口形成灌注液排出通道，生理盐水灌注至清亮液体流出。取脑组织，称取湿重。制备脑组织匀浆，加3 mL甲酰胺溶液，60 ℃恒温箱孵育48 h，1 600 r/min离心25 min，取上清液，分光光度计于波长632 nm处测定吸光度值。绘制标准曲线计算EB浓度，根据公式计算EB含量，以此表示血脑屏障通透性。EB含量(μg/g脑湿重)=EB浓度(μg/mL)×甲酰胺容积(mL)/湿重(g)。

1.8 脑组织ROCK2、Claudin5蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。将上述取尾静脉血后的大鼠常规称重、麻醉，暴露心脏，固定灌注针，按1.6方法灌注生理盐水。待清亮液体流出后，换成4%多聚甲醛灌注，直至大鼠上半身僵硬。迅速断头取脑组织，常规甲醛固定，石蜡包埋，切片、脱水、PBS反复漂洗；EDTA微波修复、PBS漂洗、避光孵育、漂洗；加封闭液、去除封闭液加一抗ROCK2、Claudin5，4 ℃过夜，PBS漂洗后加二抗孵育50 min，PBS漂洗；加DAB溶液在显微镜控制显色，冲洗；苏木素复染，氨水返蓝，冲洗，梯度乙醇脱水、透明、封固，普通光学显微镜(400×)下观察脑组织染色情况。应用Image-Pro Plus6.0软件选取相同的棕黄色作为阳性标准，分析每张照片阳性的累积光密度值(IOD)。

2 结果

2.1 四组干预不同时间神经功能评分比较 见表1。

表1 四组干预不同时间神经功能评分比较(分，

2.2 四组干预不同时间血清TNF-α、IL-1β水平比较 见表2。

表2 四组干预不同时间血清TNF-α、IL-1β水平比较

2.3 四组干预不同时间脑组织含水量及血脑屏障通透性比较 见表3。

表3 四组干预不同时间脑组织含水量及EB含量比较

2.4 四组干预不同时间脑组织ROCK2、Claudin5蛋白表达比较 见表4。

表4 四组干预不同时间脑组织ROCK-2、Claudin5蛋白表达比较

3 讨论

虾青素属于萜烯类不饱和化合物，分子式为C40H52O4，具有很长的共轭烯烃双键，其两个终端均含酮基和羟基，极性端可猝灭单线态氧，非极性中间段又能清除氧自由基，故其具备超强的抗氧化能力[6，7]。此外，虾青素还能够抑制ROS，调控Nrf2通路[8]；参与线粒体调控的凋亡通路，抑制caspase3表达；调控炎症反应等[3，9]。研究显示，虾青素可以通过超强的抗氧化能力改善蛛网膜下腔出血小鼠的血脑屏障通透性，保护血脑屏障[10]。脑出血后，氧化应激、炎症反应及基质金属蛋白酶等因素都会使血脑屏障破坏，渗透性改变，造成脑组织内环境紊乱，加剧脑出血后继发性脑损伤。本研究结果显示，大鼠脑出血后1、3、7 d神经功能均有不同程度的受损，其中3 d时的神经缺损症状最严重；经虾青素治疗后，神经功能得到明显改善，以高剂量组效应更明显。同时大鼠脑出血后各时间点的脑组织含水量、EB含量明显升高，而虾青素治疗组的脑组织含水量及EB含量均低于模型对照组，并能明显改善3 d脑水肿高峰期的脑水肿程度，降低脑疝形成风险，从而改善大鼠的神经缺损症状，具有一定的神经保护作用。

血脑屏障是由小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、紧密连接等构成的一道血液与脑组织、脑脊液之间的屏障，具有选择性转运、维持脑组织内环境稳定的重要作用，也对脑水肿的形成和发生起着关键作用[11]。ROCK2和Claudin5蛋白是调节血脑屏障通透性的重要因子。ROCK2即Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2，主要在大脑、脊髓表达，其底物有肌球蛋白轻链磷酸酶、肌球蛋白等，具有调节血管内皮细胞收缩、黏附、迁移、凋亡等作用[12]。同时被认为是调节血脑屏障通透性的有效靶点，其与LPS诱导的紧密连接蛋白水平降低有关[13]。脑出血后血肿所释放的凝血酶、血红蛋白及分解代谢产物可能会激活ROCK2蛋白，使其表达水平增加，活化后的ROCK2可增加基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达，降解细胞外基质的层粘连蛋白及内皮细胞间的紧密连接，造成血脑屏障结构和功能破坏，加重脑水肿[14]。紧密连接是血脑屏障的重要组成部分，包括跨膜蛋白(Claudins、occludin、连接黏附分子)、胞质附着蛋白、细胞骨架蛋白等[15]，具有主动调节功能，紧密连接的改变可造成血脑屏障结构和功能异常。Ohtsuki等[16]发现，外源性表达的Claudin5可诱导血脑屏障生成，Claudins还可参与氧化应激、胞内钙离子吸收等病理生理过程，在缺血性脑损伤时，Claudin5被MMP降解，血脑屏障渗透性升高，同时它也是重要的渗透性调节因子，其下降程度可反映血脑屏障通透性的破坏情况[17]。

本研究结果显示，脑出血大鼠成模1 d时模型对照组、虾青素治疗组脑组织中ROCK2蛋白表达水平开始升高，Claudin5蛋白表达减少，3 d时效应最明显。这与血脑屏障通透性增加、脑组织含水量升高结果一致，说明脑出血后ROCK2蛋白激活导致Claudin5蛋白被分解，破坏了血脑屏障紧密连接，加剧脑组织水肿；而与模型对照组相比，虾青素治疗组各时间点脑组织中ROCK2蛋白表达减少，Claudin5表达升高，脑水肿程度减轻，血脑屏障通透性得到改善。这提示虾青素可能通过抑制ROCK2过度表达起到保护脑组织的作用，且高剂量组优于低剂量组。另一方面，脑出血后大鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α水平升高，这可能与活化的ROCK2促进NF-κB向核内转移，加剧炎症反应、免疫反应有关;虾青素治疗组不同时间点IL-1β、TNF-α水平较模型对照组均下降，提示虾青素可抑制脑出血后的炎症反应，从而减轻细胞毒性脑损害，发挥神经保护作用。

综上所述，虾青素能够抑制脑出血后的炎症反应，减轻细胞毒性脑损害；同时改善血脑屏障通透性和减轻脑水肿，改善脑出血大鼠早期脑损伤的神经功能；其机制可能是通过抑制ROCK2蛋白表达、保护Claudin5蛋白来发挥作用。