肺癌细胞中PIK3AP1基因表达变化及其过表达对细胞增殖、侵袭、迁移的影响

杜玮，黄秋敏，严飞

天津医科大学，天津300070

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，根据病理类型可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中小细胞肺癌虽然所占比例不高(约15%)，对放化疗敏感，但其恶性程度高，生长迅速，治疗后极易复发或出现远处转移[1]。近年来，免疫检测点抑制剂为小细胞肺癌的治疗提供了新的方法，然而对于小细胞肺癌特异的免疫治疗靶点目前仍不清楚[2]。PIK3AP1基因编码的蛋白为BCAP，最初被鉴定为B细胞中与PI3K的p85亚基结合的一个适配器分子，通常表达于B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞，但不表达于T细胞和肥大细胞[3～7]。PIK3AP1对B细胞成熟、增殖以及免疫球蛋白的产生具有重要作用，当B细胞受体与配体结合后，在PIK3AP1中YXXM基序上的酪氨酸进行磷酸化，磷酸化的PIK3AP1与PI3K结合并诱导激活下游的AKT蛋白磷酸化，进而调控下游靶基因表达[8～10]。但在巨噬细胞和NK细胞中，PIK3AP1则成为了炎症的负调控因子，通过Toll样受体(TLRs)和NK细胞受体抑制细胞成熟并促进细胞凋亡。有研究显示，PIK3AP1与肺癌的发生发展相关[11]，然而对其在肺癌中的表达情况及作用机制目前尚不清楚。2017～2020年，我们观察了非小细胞肺癌和小细胞肺癌中PIK3AP1基因的表达情况，分析PIK3AP1基因表达水平与肺癌患者预后的关系，并观察PIK3AP1基因过表达对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人支气管上皮细胞系HBEC，人非小细胞肺癌细胞系A549、HCC827、H358，人小细胞肺癌细胞系H69、H526、H82，人肾上皮细胞系293T，均购自美国ATCC细胞库。胎牛血清购自以色列BI公司；DMEM、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；305慢病毒过表达载体；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；Transwell小室、Matrigel胶购自美国Corning公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；PCR引物由中国金唯智公司合成；抗AKT抗体、抗p-AKT抗体购自美国CST公司、抗β-actin抗体购自美国Millipore公司，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自中国Abclonal公司。

1.2 不同类型肺癌细胞中PIK3AP1 mRNA表达检测

1.2.1 细胞培养 HBEC细胞培养于含40 μg/mL内皮细胞生长添加物(ECGS)、10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，A549、HCC827、H358、H69、H526、H82细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。置于37 ℃、5% CO2的培养箱，待细胞贴壁后，融合度约90%时，加入胰酶消化，按照1∶3比例传代。

1.2.2 细胞PIK3AP1 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增引物序列：PIK3AP1上游5′-ATCACCCGAAGACAGAGAGA-3′，下游5′-GGTAACCTCAGGGACTTCATTATC-3′；GAPDH上游5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环。取PCR扩增产物，常规行琼脂糖凝胶电泳，Image J软件观察电泳条带的亮度。以GAPDH为内参，计算各类型细胞中PIK3AP1 mRNA的相对表达量。相对表达量<0.1为不表达，0.1～0.5为低表达，>0.5为高表达。

1.3 肺癌组织中PIK3AP1 mRNA表达与患者预后的关系分析 采用KMplot数据库(http://kmplot.com/analysis/)。该数据库包括基因表达综合数据库(GEO)来源的1 880例肺癌患者的PIK3AP1 mRNA表达以及临床随访信息，采用Kaplan-Meire法绘制生存曲线，由PIK3AP1探针(Affymetrix ID 1554508_at)进行预测，组间比较采用Log-Rank检验。

1.4 PIK3AP1过表达对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响观察

1.4.1 305-PIK3AP1质粒的构建 以小细胞肺癌的cDNA为模板，PCR扩增PIK3AP1的cDNA，引物上加入BamH Ⅰ酶切位点，上游引物5′-TTGGATCCGCCACCATGGCAGCCTCAGGG-3′，下游引物5′-TTGGATCCTCAGCGTCCTCTGGGTGGAA-3′。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30个循环。使用胶体收试剂盒对扩增片段进行回收，用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切回收的DNA，并连接到305载体上，经测序后获得正确的克隆。

1.4.2 病毒制备与感染 取293T细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，至细胞融合度80%。弃上清，加入不含血清的DMEM培养基。将辅助质粒Rev(2.5 μg)、VSVG(3 μg)、Pmdl(5 μg)与目的质粒305-PIK3AP1或305-empty(12 μg)混合，加入DMEM培基至500 μL。取60 μL PEI转染试剂，与DMEM培养基混合至500 μL。将质粒混合液与转染试剂混合液充分混匀，加入293T细胞中作用4 h。弃上清，换成含10%胎牛血清的DMEM培养基。转染后24、48、72 h收集细胞上清液，用0.45 μm的滤器过滤，即为制备的病毒。

1.4.3 细胞分组与感染 取不表达PIK3AP1的肺癌细胞，培养至细胞融合度60%～70%时，弃培养液，分为观察组和对照组。观察组加入305-PIK3AP1病毒，对照组加入305-empty病毒，培养12 h后更换为正常培养基，感染2～3次。

1.4.4 细胞增殖能力观察 采用BrdU法。收集两组细胞，加入胰酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度为1.5×104/mL，按100 μL/孔加入96孔板，培养24 h。孔板中加入10×BrdU溶液孵育6 h。弃上清，加入FixDenat溶液，室温反应30 min。去掉上清，加入100 μL检测抗体溶液，室温反应2 h，Washing Buffer洗3次；加入100 μL底物，室温反应30 min；加入H2SO4终止反应。上酶标仪，于450 nm波长处检测吸光度(A)值。

1.4.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell实验。收集两组细胞，用0.1% FBS的培养基重悬，调整细胞密度为1×106/mL。将其接种到Matrigel包被的Transwell小室上层，每孔加入100 μL，小室下层放入完全培养基，生长24 h后用棉签擦去Transwell中的Matrigel，对Transwell底部或小室下层的细胞进行计数。

1.4.6 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。收集两组细胞，加入胰酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度为5×105/mL，按100 μL/孔接种于24孔板内。待细胞长至融合度80%以上，用黄色枪头在每孔中垂直划线，观察0、24 h划痕愈合情况并拍照。采用Image J软件计算划痕宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.4.7 细胞PI3K/AKT通路相关蛋白AKT、p-AKT蛋白检测 采用Western blotting法。收集两组细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，用10%的SDS-PAGE胶进行电泳分离。300 mA恒流转膜，室温封闭1 h。5%脱脂牛奶稀释AKT抗体(1∶1 000)、p-AKT抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶5 000)。加入稀释后的一抗，4 ℃过夜。加入稀释的二抗，室温孵育2 h。洗涤3次后，利用GE的Imager 600凝胶成像系统进行显影。采用Image J软件分析待测蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 不同类型肺癌细胞中PIK3AP1 mRNA表达比较 PIK3AP1 mRNA在HBEC、A549细胞中的相对表达量分别为0.04±0.00、0.09±0.00(不表达)，在HCC827、H358中的相对表达量分别为0.33±0.01、0.19±0.00(低表达)，在H69、H526、H82中的相对表达量分别为0.57±0.02、0.87±0.01、0.72±0.04(高表达)。

2.2 肺癌组织中PIK3AP1 mRNA表达与患者预后的关系 1 880例患者中，PIK3AP1 mRNA高表达者的中位生存期为60.73个月，PIK3AP1 mRNA低表达者的中位生存期为92.63个月，两组比较差异有统计学意义(HR=1.46，P<0.05)。见图1。

图1 肺癌组织中PIK3AP1 mRNA表达的Kaplan-Meier plotter生存分析结果

2.3 PIK3AP1过表达对A549细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响观察结果

2.3.1 两组细胞增殖能力比较 对照组和观察组的A值分别为1.24±0.122、1.52±0.15。观察组细胞增殖能力高于对照组(P<0.01)。

2.3.2 两组细胞侵袭能力比较 对照组和观察组的穿膜细胞数分别为(88±13)、(201±23)个。观察组穿膜细胞数多于对照组(P<0.01)。

2.3.3 两组细胞迁移能力比较 对照组在24 h时的细胞迁移率为37.45%±1.48%，观察组为39.10%±2.26%。两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3.4 两组AKT、p-AKT蛋白表达比较 对照组和观察组p-AKT蛋白相对表达量分别为0.37±0.02、1.01±0.10，观察组高于对照组(P<0.05)。两组AKT蛋白相对表达量分别为1.23±0.15、1.31±0.13，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

小细胞肺癌是最致命的恶性肿瘤之一，属于神经内分泌肺癌，支气管肺树是最常见的原发部位，5年存活率小于7%。与非小细胞肺癌相比，小细胞肺癌具有较高的转移能力和增殖能力，且耐药后极易复发[12]。因此，寻找小细胞肺癌诊断和治疗的潜在分子标志物是目前亟待解决的问题。

PIK3AP1是B细胞受体和CD19下游PI3K/AKT信号转导通路的适配器，能与PI3K的p85亚基结合。该蛋白包含许多潜在的蛋白质-蛋白质相互作用结构域，但不包含任何酶催化结构域。通过蛋白质之间的相互作用，PIK3AP1可以协调受体和非受体酪氨酸激酶下游的多个细胞内信号。正常生理条件下，PIK3AP1主要在血细胞中发挥功能。缺失PIK3AP1主要表现为外周B细胞群的缺陷，脾脏中B细胞总数减少，并出现未成熟表型，即IgMhighIgDlow比例增多，IgMlowIgDhigh比例减少[10]。因此，PIK3AP1对于B细胞发育和活化是不可缺少的。除了B细胞，PIK3AP1还在NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞中表达。PIK3AP1敲除小鼠的NK细胞表现出增强的杀伤细胞能力，产生更多的干扰素γ(IFN-γ)，对细胞凋亡具有更强的抵抗力，并且更容易达到完全成熟的状态[3]。这表明PIK3AP1对NK细胞的发育和成熟具有负向调节作用。PIK3AP1缺失的巨噬细胞展现出增强的TLR诱导的TNF、IL-6、IL-12 p40[4,5]，说明该基因抑制了巨噬细胞的功能。Chu等[6]报道，与野生型小鼠相比，PIK3AP1基因缺失的小鼠给予TLR9拮抗剂后，血清中产生较少的IFN-α，浆细胞样DC中PIK3AP1能够通过TLR7/9信号转导促进IFN-α的产生。经典DC中的PIK3AP1缺乏会导致PI3K/AKT信号的激活降低，以及TLR4激活后的MyD88依赖的NF-κB信号激活的延长[7]。这些矛盾的结果表明，PIK3AP1以细胞类型特异性方式发挥不同的作用。此外，Sinclair等[13]报道，PIK3AP1基因在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的患者中发生缺失突变，说明该基因与B-ALL的发生发展密切相关。在实体肿瘤中，有研究表明PIK3AP1基因的突变与肺癌、头颈癌的进展相关[14,15]，说明该基因在实体肿瘤的发生发展中也起到了重要作用。

本研究结果显示，在具有高转移能力的小细胞肺癌细胞中PIK3AP1 mRNA呈高表达，而在非小细胞肺癌细胞和正常支气管上皮细胞中则不表达或低表达。Kaplan-Meier生存分析显示，PIK3AP1基因高表达预示肺癌患者较差的预后。在不表达PIK3AP1的A549细胞中过表达PIK3AP1基因，发现PIK3AP1过表达能够促进A549细胞的增殖和侵袭能力，但不影响细胞迁移能力。这表明PIK3AP1过表达的细胞具有较高的侵袭能力和增殖能力，而这正是小细胞肺癌的特征。因此推测，PIK3AP1基因促进了肺癌的进展，并可能成为小细胞肺癌治疗的新靶标。

PI3K/AKT信号通路在多种肿瘤中被异常激活，并通过调控下游靶基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Ⅰ型PI3K蛋白是由催化亚单位p100和调节亚单位p85所组成的异源二聚体蛋白。正常生理条件下，PI3K被募集于细胞表面生长因子受体或连接蛋白的SH2区域，并结合于受体或连接蛋白保守的磷酸酪氨酸残基上，引起二聚体构象改变而被激活。激活的PI3K在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞中具有PH结构域的信号蛋白PDK1和AKT募集到细胞膜上，促使PDK1磷酸化AKT蛋白。AKT一旦被激活，可以介导多个靶点的活化和抑制，通过多种机制促进细胞的存活、生长和增殖[16，17]。Zhang等[18]报道，胃癌中PIK3AP1表达显著上调，并通过PI3K/AKT通路调节胃癌的生长和化疗抵抗。本研究发现，PIK3AP1过表达的A549细胞中p-AKT显著上调，而总AKT无明显变化,说明在肺癌细胞中高表达的PIK3AP1也能激活PI3K/AKT信号通路，进而促进肺癌细胞的增殖和侵袭。提示PIK3AP1可能在多种肿瘤中表达上调，通过激活PIK3/AKT信号通路来促进肿瘤进展。

综上所述，PIK3AP1基因在肺癌细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞，尤其在转移能力强的小细胞肺癌细胞中高表达，并与患者较差的预后相关；PIK3AP1在肺癌中能够激活PI3K/AKT通路，促进细胞的增殖和侵袭，但对细胞的迁移无明显影响。PIK3AP1有可能成为肺癌诊断、靶向治疗和预后评估的生物标志物。