无托槽隐形矫治器对口腔微环境影响的相关性研究

李 佩，陈 曦，林 彤，郭 莉

随着物质生活水平的提高，人们对口腔健康的关注及美学诉求也越来越高[1-2]。近年来，隐形无托槽矫治器以其美观、舒适、可摘戴等优点，受到广大正畸医师及患者的青睐[3-4]。

但是佩戴隐形矫治器可能对口腔环境产生影响。众所周知，口腔的自洁作用是一种重要的保护机制，这与唾液的理化性质密切相关。研究表明，唾液腺功能障碍者，口腔黏膜疾病、牙周炎症及龋坏的发生率显著增高[5]。而隐形矫正器包裹整个牙面的特点限制了唾液的冲洗作用，使局部唾液流速降低、粘度增大，长期佩戴可能会对口腔微环境及菌群产生一定影响[6-7]。

因此，本研究纳入符合标准的正畸患者，给予隐形矫治，通过待测指标的变化，客观地分析隐形矫治器对口腔微环境的影响，为该技术的临床应用提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年10月至2018年10月于西安市第九医院口腔科就诊的10例正畸患者为研究对象，纳入标准：①牙齿健康，无活性龋、氟斑牙或四环素牙等；②口腔卫生良好，无明显偏侧咀嚼习惯，依从性高，可按时复诊；排除标准：①未治愈的各类口腔黏膜病、牙周病、口腔肿瘤等患者；②存在龋病易感因素，包括影响口腔功能的系统性疾病，如舍格伦综合征、糖尿病等及近期接受放化疗患者等。研究方案通过西安市第九医院伦理委员会审批，患者签署知情同意书，实验开始前由专业医务人员进行口腔卫生健康宣教。

1.2 研究方法

受试者采用无托槽隐形矫治技术，拍摄口腔全景片和头颅侧位片，取硅橡胶印模，设计方案并制作隐形矫治器(上海正雅齿科科技股份有限公司生产)，嘱患者每日佩戴时间≥20 h，每2周更换1次，佩戴期间保持口腔卫生。于治疗前(T0)、治疗后4月(T1)、治疗后8月(T2)记录患者的PLI和GI，并采集唾液标本送检。

1.3 评价方法

1.3.1 临床指标的测量 待测牙位参考Ramfjord指数牙[8]即16、21、24、36、41、44。PLI的测量采用改良的Q-H菌斑指数，每颗牙检查唇(颊)舌面，用菌斑指示剂染色，停留3 min后漱口，根据牙面染色部位的分布范围记分。GI的测量采用Loe和Silness的诊断标准，每颗牙检查唇(颊)面的近中乳头、正中龈缘、远中乳头及舌侧龈缘。由同一医师完成全部临床指标的测量与记录。牙齿的得分为该牙各个位点记分的平均值，个人记分为全部待测牙位记分的平均值。计分标准如下。

菌斑指数(PLI)：0=牙面无菌斑；1=牙颈部龈缘处有散在的点状菌斑；2=牙颈部连续窄带状菌斑宽度不超过1 mm；3=牙颈部连续窄带状菌斑宽度超过1 mm，但少于牙面1/3；4=菌斑覆盖面积至少占牙面1/3～2/3；5=菌斑覆盖面积占牙面2/3或以上。

牙龈指数(GI)：0=牙龈健康；1=牙龈轻度炎症，颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血；2=牙龈中等炎症，色红，水肿光亮，探诊出血；3=牙龈严重炎症，明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。

1.3.2 16S rDNA基因测序 唾液的采集：在晨起未进食或饭后3～4 h收集唾液约5 mL，转入离心管，4 ℃下离心10 min，转速7 000 r /min，吸取上清液分装入EP管，-70 ℃保存。样品总DNA提取：按照试剂盒说明书(江苏凯基生物技术有限公司提供)提取样品总DNA，-20 ℃保存。

细菌16S rDNA基因扩增：选择16S rRNA基因V4区域的通用引物序列(武汉承启医学科技有限公司合成)，引物上游：V4F-5′-GAGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，引物下游：V4R-252-5′-TTAGGAGA-CCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反应体系25 μL：10×Buffer缓冲液5 μL，2.5 mmol/L dNTP (含4种脱氧核苷酸)2.0 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL(5 U/μL)，引物各12.5 pmol/μL，细菌DNA提取液1 μL，三蒸水17.7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

Illumina Solexa测序:样品上机测序之前进行凝胶电泳检测，Illumina Hi Seq平台进行测序。

1.4 数据处理和统计学分析

为了研究菌群多样性，对所有样品的Effective Tags进行聚类[9]，利用Green Gene数据库进行物种注释，在门纲目科属等水平上统计各个物种的相对丰度。用Qiime1.9.1软件对样品Alpha多样性指数进行计算并绘制相应的曲线。

采用SPSS 20.0进行统计学分析，不同观察时间点PLI和GI的组内比较采用方差分析，不同水平菌群构成比的组内比较采用卡方检验，当P<0.05时差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗前后PLI和GI的变化

与治疗前相比，治疗后受试者的PLI和GI呈上升趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 患者治疗前后临床指标的比较Tab.1 Comparison of clinical index before and after treatment 分

2.2 治疗前后16S rDNA测序结果分析

2.2.1 数据处理和质量控制 30个样本共获得980 795条原始基因序列，进行筛选优化后共获得933 470条有效序列，以此为基础进行后续分析。

2.2.2 Alpha多样性分析 Alpha多样性用于分析样品内的群落多样性，常用Shannon和Simpson指数表示，指数值越大，说明样品中微生物群落多样性越高；反之，越低。实验结果显示，随着治疗时间的延长，受试者口腔菌群的多样性增高，见图1。

2.2.3 门水平口腔菌群相对丰度的分布情况 本实验通过基因测序共测得16个菌门，其中，相对丰度最高的5种菌门依次为：变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)、放线菌门(Actinobacillus)和梭杆菌门(Fusobacterium)。

图1 Shannon和Simpson指数

在治疗前后其构成比有所改变，其中变形菌门含量呈下降趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)；放线菌门和梭杆菌门含量呈上升趋势，差别无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 门水平相对丰度柱形图

2.2.4 属水平口腔菌群相对丰度的分布情况 本实验通过基因测序共测得281个菌属，相对丰度最高的前6种菌属依次为：埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、萨特氏菌属(Sutterella)、 嗜血杆菌属(Haemophilus)和奈瑟菌属(Neisseria)。在治疗前后其构成比发生变化，但差别无统计学意义(P>0.05)(奈瑟菌属除外)，见图3。此外，我们分析了龋病和牙周病的优势致病菌，包括链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、放线菌属(Actinobacillus)和奈瑟菌属(Neisseria)的相对丰度变化，结果显示：随着治疗时间的延长，其含量均呈增加趋势。其中，链球菌属、放线菌属和奈瑟菌属在T2的含量显著高于T0，差别有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图3 属水平相对丰度柱形图

表2 相关致病菌属含量变化Tab.2 Relative abundance change of pathogenic bacteria

3 讨 论

近年来，很多学者进行了隐形矫治器与传统托槽矫治器对口腔健康影响的比较研究，一致认为隐形矫治器在减少龋病和牙龈炎等正畸并发症方面有显著优势[10-11]。压膜保持器的佩戴可促进龋病及牙龈炎的发生发展[12]。Low等发现佩戴隐形矫治器6 h后其边缘及表面凹陷处可观察到菌斑的积聚[13]。此外，有研究指出，随着矫治器佩戴时间的增加，其理化性能衰减，出现明显的磨损及粗糙度增加，这为口腔细菌附着创造了条件，即使在清洁之后仍可见菌斑生物膜[14]。为了进一步证实隐形矫治器的佩戴对口腔微坏境的影响，我们进行相关研究。

实验结果显示，佩戴隐形矫治器前后受试者的PLI和GI呈上升趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)。这说明，在8个月的观察期内隐形矫治器的佩戴尚未造成口腔软硬组织的实质损害。但临床指标仅描述了组织改变的结果，而唾液菌群结构和功能的变化可作为标记预测龋病和牙周病的发生[15-17]。

16S rDNA基因测序作为一种准确可靠的微生物研究方法，被广泛应用于口腔细菌的鉴别和分离[18]。Alpha多样性分析结果显示，随着治疗时间的延长唾液中菌群多样性增加。Camelo-Castillo等学者[19]认为菌群多样性与牙周炎症呈正相关，这提示我们隐形矫治器对牙周组织健康在某种意义上有一定的影响。

为了研究菌群多样性的具体构成，我们将待测序列进行聚类和物种注释，在门水平上测得相对丰度最高的5种菌门：其中变形菌门含量呈下降趋势，而放线菌门和梭杆菌门含量呈上升趋势，但差别均无统计学意义(P>0.05)，这与前期学者研究结果较为一致[7]。在属水平，龋病和牙周病相关致病菌即链球菌属、放线菌属和奈瑟菌属，在治疗后含量显著增加，T2与T0时期相比差别有统计学意义(P<0.05)。链球菌属在口腔天然菌群中占得比例很大，其不同菌种均与龋病发生有一定关系，龋病流行人群中检出率更高，是公认的主要致龋菌。放线菌属作为龈上、龈下菌斑的长居菌，常与根面龋和牙龈炎的发生相关。奈瑟菌属在菌斑中具有双向调节作用，因其降解乳酸而可能具有减少菌斑致龋性的能[20-21]。本实验中致病菌的含量显著增加，却未引起临床损害，可能的原因有两点：①其含量的增加并未引起菌群生态平衡的破坏，而是在机体代偿机制的作用下，达到了新的动态衡；②在治疗初期，奈瑟菌属降解乳酸的作用在一定程度上削弱了链球菌属和放线菌属的致病性，阻止或减慢了相关疾病的进展。

综上所述，观察期间隐形矫治器的佩戴会对口腔微环境产生影响，具体表现在菌群多样性和相对丰度的改变，但并未引起菌群失调，临床上也未观察到口腔软硬组织的实质性损害。然而，更长时间的佩戴是否会导致其他变化，仍需进一步探究。