成牙本质细胞分化信号通路研究进展

2020-09-28田子璐刘艺萍孙宏晨倪世磊

口腔医学 2020年9期

田子璐，刘艺萍，王珏，朱松，孙宏晨，倪世磊

成牙本质细胞是由牙髓干细胞分化而来的终末分化细胞，是形成牙体组织的主要细胞之一。目前普遍认为，信号分子与牙髓干细胞受体结合后将信息传导入细胞核，引发 DNA转录以及相关蛋白质的表达，最终在多信号通路共同作用下完成成牙本质细胞分化。本文依据近年来研究成果归纳了Smad、MAPK、Wnt、Notch等影响成牙本质细胞分化的信号通路[1]。

1 Smad信号通路

Smad信号通路是影响成牙本质细胞分化的重要信号通路之一，转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等多种信号分子作用于该通路继而影响成牙本质细胞分化[2-3],见图1。按照各自的结构及功能，Smad蛋白(Smad1～Smad9)被分为受体调节型Smads(R-Smad)、共同中介型Smads(C-Smad)、抑制型Smads(I-Smad)。R-Smad包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9；I-Smad包括Smad6、Smad7；目前发现的C-Smad只有Smad4[4]。R-Smad中，Smad2、Smad3参与TGF-β信号传导；Smad1、Smad5、Smad8参与BMP信号传导。R-Smad被TGF -β或BMP受体激活发生磷酸化，磷酸化R-Smad与C-Smad形成异源寡聚物，该寡聚物可与DNA结合蛋白或DNA序列结合进而调控目的基因的表达；I-Smad与R-Smad存在竞争关系，通过抑制R-Smad磷酸化可抑制Smad信号通路[5]。Smad4是目前发现的唯一C-Smad，在胚胎发育过程中的口腔上皮细胞和间充质均有表达，因此Smad4是信号传递的关键中介物。但磷酸化的Smad1、Smad5、Smad8能够在细胞中累积，独立于Smad4传导BMP信号，因此敲除Smad4基因后成牙本质细胞分化和牙本质形成过程中并未出现明显异常[6-8]。

1.1 TGF-β引导Smad信号通路对成牙本质细胞分化的影响

TGF-β在哺乳动物中的亚型包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，是诱导上皮细胞、间充质细胞增殖、分化、凋亡的信号分子[9]。成牙本质细胞表面分布有大量的TGF-βⅠ、Ⅱ型受体。有实验发现，当牙髓受刺激后，新形成的成牙本质样细胞表面TGF-βⅠ型受体、Smad2以及Smad3活性明显高于一般成牙本质细胞[5]；敲除TGF-β Ⅱ型受体基因的大鼠牙本质明显变薄并伴有基质分泌减少以及细胞极化消失的情况出现[10]。以上均从受体角度验证了TGF-β是一类能够促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化的生物因子，当TGF-β与TGF-β Ⅱ型受体结合后可使TGF-βⅠ型受体磷酸化，之后激活Smad2、Smad3基因表达[3,11]。

图1 TGF-β/BMP引导Smad信号通路信号转导

TGF-β各亚型中，TGF-β1、TGF-β3在成牙本质细胞内表达水平较高。在体外实验中，二者均能够刺激牙髓干细胞有丝分裂、诱导其向成牙本质细胞分化。利用TGF-β3与肝素联合诱导人牙髓干细胞生长以及成牙本质细胞样分化能够取得良好的效果[12]。然而在体内实验中，敲除TGF-β1基因小鼠牙本质矿化程度明显降低、与牙本质形成相关的牙本质涎蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达明显降低，表现出牙本质发育不良、缺陷等情况[9]；在出生后4 d的小鼠的成牙本质细胞层中TGF-β3便呈强阳性表达，之后逐渐减弱。以上均证明TGF-β1、TGF-β3在成牙本质细胞分化中起到重要作用[12]。对于TGF-β2而言，研究发现牙胚发育过程中TGF-β2 mRNA的分布具有时空特异性，可通过上皮-间充质影响成牙本质细胞分化、诱导DSPP的表达[9,13]。

1.2 BMP引导的Smad信号通路对成牙本质细胞分化的影响

BMP家族引导的Smad信号通路是一种高度保守的信号通路，已有研究证实BMP家族在诱导胚层发育、骨组织形成等方面发挥重要作用，其中的BMP2、 BMP4、BMP7等参与调控牙体组织发育，牙体早期形态学发生、细胞分化以及牙齿萌出等一系列生物学行为。

敲除小鼠成牙本质细胞BMP2基因后，其内DSPP、牙本质基质蛋白-1以及基质金属蛋白酶-9等表达明显减少;与此相同的是，当在人牙髓干细胞培养基中加入BMP2/Smad信号通路抑制剂后，标志成牙本质细胞早期分化标志的碱性磷酸酶含量明显降低。然而BMP4转染入小鼠诱导多能干细胞或人诱导多能干细胞中后可成功诱导其分化为成牙本质细胞；转染了2型腺病毒相关病毒介导BMP7或腺病毒介导的BMP-7的牙髓干细胞其碱性磷酸酶活性、DSPP表达水平均明显升高。以上实验结果均证明BMP有利于牙髓干细胞向成牙本质细胞分化[14-18]。

同TGF-β相似，成牙本质细胞表面存在两类BMP受体(BMP recepter,BMPR)，即Ⅰ型受体和Ⅱ型受体。Ⅰ型受体包括活化蛋白A受体1(activin A receptor 1,ActR 1)、BMP受体1A型(BMPR 1A)、BMP受体1B型(BMPR 1B); Ⅱ型受体包括BMPRⅡ、ActR 2A、ActR 2B。BMP与Ⅱ型受体结合后激活Ⅰ型受体，Ⅰ型受体磷酸化Smad1、Smad5、Smad8蛋白激活Smad信号通路。研究表明BMPR1A 基因敲除会导致牙体发育停滞；BMPRⅡ数量随成牙本质细胞的成熟而增多，从受体角度证实BMP与成牙本质细胞分化有密切联系[3]。

BMP家族通过Smad信号通路来调节成牙本质细胞分化。实验发现，BMP2含量与Smad1、Smad5活性成时间依赖性、剂量依赖性，在体外培养的牙髓干细胞中加入BMP2后Smad1、Smad5磷酸化水平明显提高；而加入BMP2抑制剂后结果相反[4]；Huang等验证了转染了BMP4基因的细胞较其他细胞Smad1、Smad5磷酸化水平更高[19]；Hertwig上皮根鞘中，BMP7含量增加时，Smad1、Smad5、Smad8磷酸化水平明显提高，以上结果证实Smad1、Smad5、Smad8为BMP家族下游信号分子，能够影响成牙本质细胞分化[3]。

2 MAPK信号通路

丝裂原激活蛋白酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)参与调控细胞增殖、分化以及信号传导等生理病理过程，代表的MAPK信号通路有ERK(extracellular-signal regulated kinase)信号通路、JNK(c-Junamino-terminal kinase)信号通路、p38 MAPK信号通路，各信号通路对成牙本质细胞分化都起调控作用[20]。

体外实验发现，p38 MAPK磷酸化水平与BMP2呈剂量相关性，p38 MAPK信号通路抑制剂可明显抑制BMP2诱导的成牙本质细胞分化。证明除Smad信号通路外，BMP2也可激活p38 MAPK信号通路以调节成牙本质细胞分化。被激活的p38 MAPK信号通路可磷酸化特定的转录因子，增强其反激活能力，影响相关的基因表达[21]。

根尖乳头干细胞具有分化为成牙本质细胞的潜能，在机械应力的刺激下，ERK信号通路被激活，促进根尖乳头干细胞向成牙本质细胞分化；而当ERK信号通路被抑制时，BMP9引导根尖乳头干细胞向成牙本质细胞分化能力明显下降，以上实验证明激活ERK信号通路有利于根尖乳头干细胞向成牙本质细胞分化[22-23]。

JNK信号通路与其他MAPK通路共同调控成牙本质细胞分化。当JNK信号通路被抑制后，由BMP2、 Wnt6诱导的成牙本质细胞迁移和分化受到抑制[24-25]。因此，抑制JNK信号通路不利于成牙本质细胞分化。

3 Wnt信号通路

目前已证实Wnt信号通路在调控生长发育、疾病发生发展过程中发挥重要作用。根据信号通路中是否有β-连环蛋白(β-catenin)的参与，Wnt信号通路分为经典和非经典 Wnts 蛋白信号通路。

经典Wnt信号通路在牙髓干细胞的增殖、分化等过程中可被激活发挥作用。由Wnt3a、 BMP9诱导根尖乳头干细胞向成牙本质细胞分化过程中，敲除β-catenin基因会导致碱性磷酸酶表达下降，抑制成牙本质细胞分化。因此β-catenin信号通路的正常表达对BMP9以及Wnt 3a诱导的成骨/成牙本质过程中有重要意义。相反在非经典信号通路中，过表达的Wnt 5a可提高碱性磷酸酶、牙本质基质蛋白-1、DSPP的表达，加快根尖乳头干细胞向成牙本质细胞分化[26-28]。

Wntless是一种调节Wnt蛋白分泌重要的伴侣蛋白。实验敲除将要极化的成牙本质细胞Wntless基因后，该细胞形态改变，形成的牙本质变薄，牙体组织明显缺陷。同时成牙本质细胞内Wnt 10a、Wnt 2以及与Wnt通路有关的Axin2和β-catenin蛋白的表达都明显下降，证实Wntless对成牙本质细胞分化起到间接影响[29]。

4 Notch信号通路

Notch信号通路包括三部分：Notch受体、Notch配体、DNA结合蛋白。Notch受体包括4类Ⅰ型跨膜蛋白——Notch 1、Notch 2、 Notch 3、Notch 4 。当Notch 受体与两类特异性配体——DLL型配体(Delta-like1, Delta-like3、Delta-ike4) 或者JAG型配体(Jagged1, Jagged2)结合后激活细胞酶促反应，切割Notch蛋白，释放Notch蛋白胞内结构域，而后该结构域进入细胞核与相应DNA结合位点结合，激活Hes、Hey等相关靶基因完成信号传导[30]。

研究发现，DLL型配体与JAG型配体对牙髓干细胞分化发挥相反的作用：DLL型配体与Notch受体结合可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化；而JAG型配体过度表达会明显抑制牙髓干细胞的分化。两类配体发挥相互拮抗作用，使细胞分化过程在信号调控下达到平衡状态[31]。

虽然在健康牙髓细胞中Notch 2表达微弱，但受到外界刺激后的早期前成牙本质细胞中Notch 2表达上调，接着在间充质细胞和成牙本质细胞中表达均增加。随着修复的完成，Notch 2在各类细胞中表达信号逐渐减弱，表明Notch 2参与了牙体修复过程中的成牙本质细胞分化的信号传导[32]。在脂多糖作用的小鼠成牙本质样细胞中Notch 1、Notch 2表达先增后降； Delta-like1表达先降后增；Jagged1表达逐渐降低，这表明除Notch 2外，Notch 1也参与前期成牙本质细胞分化的信号传导，促进成牙本质样细胞分化[31]。而Notch 3在前成牙本质细胞中表达明显，当分化为成牙本质细胞后表达消失，因此研究认为Notch 3能够使细胞处于未分化状态，当细胞分化后Notch 3不再表达[33]。