ISL1基因腺病毒过表达载体的构建及其诱导犬ADSCs向胰岛样细胞分化

张 霞，戴鹏秀，高登科，阮晨梅，王璟璐，李佳锴，陈奕静，张露文，张翊华

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨陵 712100)

据统计，全世界范围内糖尿病患者超过3亿人，是现代社会中一个主要且日益严重的健康问题。同时，胰岛素依赖性糖尿病作为犬的高发病，可引起犬的多饮多尿、消瘦，眼类疾病和内脏器官衰竭等[1]。目前，临床治疗糖尿病以药物和外源性胰岛素注射为主，但其只能暂时性的控制血糖升高，对于糖尿病的并发症作用甚微[2]。胰岛移植是治疗胰岛素依赖性糖尿病的理想方案，但由于高排斥反应和供体严重缺乏而难以普及[3]。因此，寻找一种更加高效、安全的糖尿病治疗方法是目前医学亟待解决的问题，探索诱导产生功能性胰岛素分泌细胞成为当前研究热点。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)来源广泛，容易分离和培养，具有多向分化潜能，移植后免疫原性低，是治疗胰岛素依赖性糖尿病的理想种子细胞[4]。

研究表明，同源盒LIM蛋白——ISL1对于胰腺的发育、分化、成熟及功能实现具有不可或缺的重要性[5]。AHLGREN等[6]研究发现，ISL1缺陷会导致小鼠背胰间质缺失，胰腺内胚层时期ISL1的功能正常是胰岛内分泌细胞增殖分化的重要条件，表明ISL1基因对于胰岛素分泌细胞的形成与功能正常化具有重要作用。但目前为止，ISL1基因在ADSCs向胰岛样细胞方向分化的作用仍未知。因此，本试验拟构建腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy，经293A细胞的包装和扩增获得具有感染性的重组腺病毒，将其按感染复数(MOI)=100感染犬ADSCs，观察感染后4，7，10，13，16 d绿色荧光蛋白表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的mRNA表达情况，以此探讨ISL1过表达对犬ADSCs向胰岛β细胞分化的影响和意义，为进一步获得有功能的胰岛β细胞提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂pAdTrack-CMV、Stbl3、BJ5183-AD-1(北京华越洋生物科技有限公司)；293A细胞、犬ADSCs由西北农林科技大学动物医学院外科实验室保存；无内毒素质粒提取试剂盒、EasyGeno快速重组克隆试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(杭州博日科技有限公司)；2×Prime STAR Max Premix、BglⅡ酶、HindⅢ酶、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa，Japan)；PacⅠ酶、PmeⅠ酶(New England Biolabs，USA)；Asvanced Transfection Reagent (ZETA LIFE，USA)。

1.2 ISL1基因的克隆使用全基因组合成技术，由武汉金开瑞公司合成ISL1基因(ISL1 ID：612954)的CDS序列，并克隆至pUC57中。使用EasyGeno Primer设计带有同源臂的引物ISL1-F和ISL1-R(表1)，其上、下游与腺病毒表达载体pAdTrack-CMV的BglⅡ、HindⅢ 处分别有20 bp的重叠区域。用高保真PCR酶扩增ISL1基因，经胶回收纯化ISL1基因片段，并进行测序验证。

1.3 pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒重组表达载体的构建与鉴定pAdTrack-CMV经HindⅢ、BglⅡ双酶切，胶纯化回收线性化载体，按照Easy Geno重组克隆试剂盒操作说明连接ISL1基因和酶切后的pADTrack-CMV，连接产物用热激法转化Stbl3感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，摇菌扩增，提取质粒，进行HindⅢ、BglⅡ双酶切、PCR鉴定和测序验证，得到质粒pADTrack-ISL1-CMV。将鉴定正确的pADTrack-ISL1-CMV腺病毒重组载体经PmeⅠ酶切，酶切产物转化入BJ5183(含Adeasy-1)感受态细胞，提取质粒，进行PacⅠ单酶切验证。

1.4 腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy的包装、扩增与鉴定将鉴定正确的pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒重组表达载体经PacⅠ酶线性化，使用乙醇沉淀法纯化腺病毒质粒，使用ZETA LIFE 公司Asvanced转染试剂介导转染293A细胞，转染24 h后定期观察绿色荧光分布和变化情况。于转染后5～8 d收集所有293A细胞与培养基，-80℃和37℃反复冻融涡旋，充分释放病毒颗粒。4 000 r/min离心10 min，收集上清为第一代病毒。第一代病毒继续感染293A细胞，同上得到第二代病毒。病毒包装到第四代时用梯度稀释法进行病毒滴度测定，并通过感染293A细胞进行qRT-PCR鉴定ISL1的mRNA表达情况。

1.5 体外培养诱导犬ADSCs 向胰岛样细胞分化相关基因的qRT-PCR检测将含有pADTrack-ISL1-AdEasy的腺病毒毒液按照MOI=100感染生长至P3代犬ADSCs，分别于感染后4,7,10,13,16 d观察ISL1基因过表达对于犬ADSCs的诱导效果，并收集犬ADSCs，提取总RNA，反转录为cDNA，进行qRT-PCR检测相关基因的相对表达量。设计PDX1、NGN3、NEUROD1、MNX1、MAFA、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、GATA-4、INS、INSM、PCSK1、PCSK2基因的引物，GAPDH为内参基因(表1)。pADTrack-0-AdEasy(空载体)为对照组。qRT-PCR反应于Step One PlusTMReal-Time PCR System中进行，反应体系配置按照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix说明书进行，每样品每基因进行3次重复验证，计算Ct值，由Ct值以及2-△△Ct决定基因的表达水平。

表1 基因信息及引物序列

2 结果

2.1 ISL1基因的克隆从含有ISL1基因的pUC57质粒中使用PCR技术克隆ISL1基因片段(携带BglⅡ和HindⅢ特定酶切位点)，基因片段大小为1 050 bp。PCR产物经电泳后可见1条约1 050 bp 的条带(图1)，与目的基因ISL1大小一致，经测序验证ISL1基因片段扩增正确。

图1 ISL1基因的PCR结果 M.DL1000 DNA Marker；1.ISL1基因PCR扩增产物

2.2 腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy的构建与鉴定用Easy Geno重组克隆试剂盒连接ISL1基因和酶切后的pADTrack-CMV，经筛选得到腺病毒重组载体pADTrack-CMV-ISL1，对其进行PCR与HindⅢ和BglⅡ双酶切鉴定(图2)，得到与ISL1基因片段大小相符的条带，约1 050 bp，成功将ISL1基因克隆至pADTrack-CMV中。腺病毒重组载体pADTrack-ISL1-CMV转化BJ5183后经筛选得到pADTrack-ISL1-AdEasy，对其进行PacⅠ 单酶切验证，得到约为30 kb和5 kb的2个条带(图3)，表明腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy构建成功。

图2 双酶切结果 M.DL15000 DNA Marker；1.pADTrack-CMV的HindⅢ和BglⅡ双酶切结果；2.pADTrack-CMV-ISL1的HindⅢ和BglⅡ双酶切结果；3.pADTrack-CMV-ISL1的PCR验证结果

图3 单酶切结果 M.DL15000 DNA Marker；1.pADTrack-ISL1-AdEasy的PacⅠ单酶切产物

2.3 腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy的包装、扩增与鉴定腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy转染293A细胞后24 h出现绿色荧光(图4A)。将转染后5～8 d收集的细胞与培养基反复冻融后，得到的毒液在293A细胞中进行病毒扩增，24 h后可见感染率达到50%以上(图4B)，扩毒2～4 d后可见明显的细胞空斑化(图4C)。感染293A细胞后收集贴壁的细胞提取总RNA，进行qRT-PCR，检测ISL1在293A 细胞中的mRNA表达情况。结果pADTrack-ISL1-AdEasy组的ISL1表达量明显高于293A细胞Negative组与腺病毒空载体pADTrack-0-AdEasy组(图4D)，说明ISL1基因在293A细胞中成功实现表达。使用梯度稀释法检测最终腺病毒毒液滴度，得到病毒液滴度为6×107TU/mL。

2.4 含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs效果观察将最终滴度为6×107TU/mL的含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液按感染复数(MOI)=100感染P3代犬ADSCs，感染后48 h，细胞开始表达绿色荧光蛋白，随后表达绿色荧光蛋白的细胞数量逐渐增加；7 d时，表达绿色荧光蛋白的细胞数量最多；感染后10 d，表达绿色荧光蛋白的细胞数量开始减少；感染后13 d，犬ADSCs开始出现形态变化，由梭形变为神经细胞样，出现类似神经突触的形状；感染后16 d，表达绿色荧光蛋白的细胞数量显著减少，几乎消失，且荧光强度减弱(图5)。将含pADTrack-0-AdEasy腺病毒毒液按感染复数(MOI)=100感染P3代犬ADSCs后，5个阶段的犬ADSCs无明显形态变化(图5)。

2.5 体外培养诱导犬ADSCs 向胰岛样细胞分化相关基因的qRT-PCR检测含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后，PDX1的表达水平于感染后7 d达到最高，之后10，13 d表达水平极显著降低，16 d表达量又出现升高；NGN3的表达水平于10 d达到最高，与其他时间点的表达水平极显著差异；MNX1的表达水平于4 d达到最高，随后7，10，13，16 d逐渐降低，并保持稳定表达；MAFA于4，7，10 d的表达量逐渐增加，13 d极显著增加，之后16 d表达量虽出现下降，但高于4，7，10 d的表达量；NKX2.2的表达量整体较低，于7 d达到最高，随后10，13 d逐渐下降，但在16 d表达量开始增加；NKX6.1于感染后4 d表达量最高，随后7 d开始降低，10 d极显著降低，但在13，16 d出现增加，并保持稳定表达；NEUROD1的表达量整体较低，在7 d达到最高，之后10，13，16 d逐渐降低；PAX4和GATA4其表达量整体较低，与pADTrack-0-AdEasy组无显著性差异；PCSK1的表达量于16 d显著增加并达到最高值，但表达量整体较低；INSM1、INSULIN、PCSK2在5个阶段均未检测到表达(图6A)。含pADTrack-0-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后，所有基因在5个阶段检测到的表达量均低于5.0或无表达(图6B)。以上结果表明，ISL1基因在犬ADSCs中过表达能够提高PDX1、NGN3、MNX1、MAFA和NKX6.1基因的内源性表达。

图4 pADTrack-ISL1-AdEasy转染293A细胞结果 A.腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy转染293A细胞24 h；B.含 pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液首次扩增24 h；C.腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy感染293A细胞出现空斑化;D.重组腺病毒表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy感染293A细胞后ISL1基因的表达量与293A细胞Negative组和腺病毒空载体pADTrack-0-AdEasy组的比较结果

图5 pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs结果 A，B，C，D，E.分别为含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后4，7，10，13，16 d的绿色荧光图片；a,b,c,d,e.分别为含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后4，7，10，13，16 d的明场图片；F,G,H,I,J.分别为含pADTrack-0-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后4，7，10，13，16 d的绿色荧光图片；f,g,h,I,j.分别为含pADTrack-0-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后4，7，10，13，16 d的明场图片

图6 相关基因的qRT-PCR结果 A.含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后4,7,10,13,16 d相关基因的表达量；B.含pADTrack-0-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs后4,7,10,13,16 d相关基因的表达量。*.P<0.05;**.P<0.01；***P<0.001

3 讨论

犬ADSCs易获取、易培养、成本低、来源广泛，且具有多项分化潜能和低免疫原性，是用于研究与治疗胰岛素依赖性糖尿病的理想种子细胞。WU等[7]研究表明，婴儿(<1岁)ADSCs的分化潜能明显高于55岁及其以上的老年人。因此，本试验选取3月龄以内的幼犬，通过外科手术获取其腹股沟脂肪，并成功分离纯化获得具有多项分化潜能的犬ADSCs，为进一步的试验奠定基础。

ISL1能够调节胰岛素基因，是编码LIM同源家族的一个转录因子，是一类在脊椎动物和无脊椎动物中控制细胞命运决定性的蛋白[6]。ISL1在成年个体所有类型的胰岛细胞中均有表达，其表达最早源于胚胎时期胰岛细胞完成细胞分裂周期后。EDIGER等[8]为研究ISL1在胰腺发育阶段第2次转换中的作用，利用Cre/LoxP技术将ISL1从发育到第13.5 天的胚胎中条件特异性的敲除，结果显示ISL1缺陷的内分泌前体细胞不能形成成熟的功能性胰岛细胞，内分泌细胞团在出生后的增殖也受到抑制，而且ISL1缺陷小鼠出生后都患有糖尿病。此外，ISL1在干细胞向胰腺内分泌细胞分化方面也具有重要的节点性作用。但目前ISL1基因在犬ADSCs中的诱导作用未知，本试验通过构建腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy，实现ISL1基因在犬ADSCs中的过表达，并在含pADTrack-ISL1-AdEasy腺病毒毒液感染犬ADSCs 13 d后，观察到细胞出现神经细胞样形态。虽然已有研究证实神经前体细胞并非干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必经过程，但是神经细胞与胰腺内分泌细胞在发育上确实有诸多相似之处。神经细胞源于外胚层，能够表达与胰岛β细胞功能正常相关的跨细胞膜运输通道等[9]。主要表达于胚胎期和成体神经干细胞的Nestin也是胰岛β细胞团的重要标志物。因此，推测本试验在犬ADSCs中过表达ISL1基因诱导形成的具有神经细胞样形态的细胞可能是胰岛样前体细胞，具有进一步诱导形成胰岛样细胞的可能。

KOJIMA 等[10]将PDX1导入小鼠未成熟的小肠干细胞中，发现尽管这些细胞能够产生多种小肠内分泌激素，但是不能够分泌胰岛素。而将ISL1与PDX1同时导入未成熟的小肠干细胞中，能够诱导其分化为胰岛素分泌细胞。EDIGER等[8]通过染色质免疫共沉淀测序分析和荧光素酶报告分析，发现ISL1能够直接占据PDX1和Slc2a2的功能调控元件。因此，ISL1对于出生后个体的β细胞正常功能实现至关重要，ISL1能够直接调控PDX1和Slc2a2，并且具有一个与胰腺内分泌祖细胞完全不同的成熟的β细胞顺反组。YANG等[11]研究表明，在HIT-T15 和NIT-1 细胞和小鼠胰岛团块中，ISL1通过与Set7/9和PDX1协作激活CyclinD1的转录来形成ISL1/Set7/9/ PDX-1复合物，促进成体胰岛β细胞增殖，而且ISL1可以直接调控MAFA的转录来共同激活胰岛素的表达。MAFA不仅是胰岛素基因的主要激活因子，而且是β细胞功能正常化的重要调节基因[12]。MNX1决定了α和β细胞的正确比例，缺少MNX1的作用β细胞前体会发展为α细胞，推测MNX1在β细胞前体中抑制自身向α细胞分化[13]。GU等[14]证明NGN3+细胞在胚胎发生期间和成年小鼠中是胰岛祖细胞，即NGN3的表达限制于胰腺内分泌祖细胞。此外，有研究表明，NKX6.1的缺失会导致β细胞表型和功能异常，NKX6.1对于胰腺β细胞的功能正常实现是必须的[15]。本试验结果表明，在犬ADSCs中过表达ISL1基因，可提高PDX1、NGN3、MNX1、MAFA、NKX6.1的内源性表达，但未检测到INSULIN、INSM1、PCSK2等与胰岛素分泌功能相关的基因表达，PCSK1在5个阶段的表达量也较低，说明ISL1的过表达能够诱导犬ADSCs向胰岛样前体细胞方向分化，存在向胰岛样细胞分化的可能性。

本试验成功构建了腺病毒重组表达载体pADTrack-ISL1-AdEasy，并于293A细胞中进行病毒包装与毒液滴度扩增，获得毒液的最终滴度为6×107TU/mL，并将含ISL1基因的腺病毒毒液成功感染犬ADSCs，实现ISL1基因在犬ADSCs中的过表达。初步分析了ISL1基因过表达在犬ADSCs向胰岛样细胞方向分化的作用，其能够诱导犬ADSCs向胰岛样前体细胞方向分化，存在向胰岛样细胞分化的可能性。