肉鸡肺动脉组织中MEOX2基因克隆与生物信息学分析

黄 橙，邵 珊，郭小权，刘 佩，王 玲，邹振兴，李谷月，李 麟，阮业召，程素芳，陈佳玲，刘 平*

(1.江西农业大学 动物科学技术学院 江西省畜禽疫病诊断与防控重点实验室 江西农业大学动物群发性疾病监测与防治研究所，江西 南昌 330045；2.山东省威海市文登区小观镇农业综合服务中心，山东 威海 264400；3.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005；4.江西生物科技职业学院，江西 南昌 330200)

肉鸡腹水综合征(ascites syndrome,AS) 又称肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)，是肉鸡在快速生长的过程中由于需氧量与心血管供氧能力之间不对称等因素造成机体相对缺氧，呈现血液黏稠、血容量增加、肝肿大、肺淤血水肿及肺动脉高压等病理现象的一种营养代谢病，其病理解剖特征为右心肥大扩张、肝脏淤血、腹腔聚积大量腹水[1-3]。在畜禽养殖过程中，该病常呈现出群发性发病，以2～3周龄快速生长的仔鸡最为易感，其发病率高达5%以上，死亡高峰期多见于4～8周龄且转归期仍伴随死亡现象发生，每年可给全球肉鸡养殖业造成巨大的经济损失；因此，AS被认为是制约养鸡业快速发展的重要因素之一[4-6]。

AS是由多种致病因子共同作用形成的疾病，其发病机理尚未明确，但当前研究普遍认为诱发心力衰竭的肺动脉高压是AS形成的中心环节，且缺氧所造成的血管内皮损伤也可加剧AS的发生[7-9]。相反，血管活性物质可影响机体肺动脉高压的发生发展，从而影响AS的发生[10-11]，这是由于血管活性物质可以通过转录因子与基因启动子结合细胞表面受体并激活信号通路，调节血管生成表型减轻血管内皮损伤从而减少AS发生，而间充质同源盒蛋白2(mesenchyme homeobox,MEOX2)，作为在血管平滑肌细胞和血管内皮细胞增殖和分化中具有重要调控功能的转录因子，可能通过控制血管生成表型从而抑制AS的发生，具有重要的研究意义[9，12-14]。同样在本实验室前期对肉鸡肺动脉血管转录组分析中发现与对照组相比腹水肉鸡MEOX2基因表达量下降，这验证了MEOX2与AS肺动脉重构有密切的关系[15]。

MEOX(mesoderm homeobox) 基因又称中胚层同源盒基因，可分为2种亚型MEOX1和MEOX2，其中MEOX2在正常血管内皮中表达，并强烈抑制生长因子刺激下内皮细胞的活化及血管的形成；同时，在促血管形成生长因子刺激下，其可抑制内皮细胞向血管生成表型的转化，从而对血管生成具有负调控作用[16]。本试验中，使用 PCR 扩增方法得到MEOX2基因，运用 TA 克隆技术获得 pUCm-T-MEOX2 重组质粒，对其进行生物信息学分析，旨在为MEOX2基因原核高效表达、蛋白纯化提供参考，并与肺动脉高压之间的联系提供有力依据，为AS的调控防治机制提供可鉴之资。

1 材料与方法

1.1 试验样品及主要试剂肉鸡的肺动脉组织由江西农业大学动物科技学院临床兽医学研究室保存，用于 RNA 提取；双酶切位点选择BamⅠ和 HindⅢ、基因组 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒、T4DNA连接酶购自大连TaKaRa生物公司；感受态细胞Top10和真核表达载体pUCm-T 由本室提供。

1.2 引物设计与合成参照GenBank上发表的 MEOX2(登录号:CR536553.1)基因序列及其相关文献，用 Primer 5.0 软件在其完整的阅读框架内设计上、下游引物并添加相应酶切位点序列。上游引物P1：5′-CGCGGATCCATGGATCACACACTC-TTT-3′(划线处为BamⅠ酶切位点)；下游引物P2：5′-CCCAAGCTTTCATAAGTGTGCGTGCT-C-3′(划线处为HindⅢ酶切位点)。用于扩增MEOX2基因，引物均由诺唯赞生物公司所提供。

1.3 MEOX2 基因的PCR扩增运用PCR 技术对MEOX2基因进行扩增，采用20 μL 体系，95℃ 预变性3 min 后进入循环：95℃ 变性1 min，58℃ 退火45 s，72℃ 延伸 90 s 的条件下进行35个循环，最后72℃ 延伸7 min，4℃ 保存。扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 MEOX2基因的TA克隆PCR产物利用胶回收试剂盒回收纯化并采用TA克隆技术连接至 pUCm-T 载体，再用限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ对重组质粒 pUCm-T-MEOX2 进行双酶切鉴定。最后将经1%琼脂糖凝胶电泳检测为阳性的重组质粒送 TaKaRa 生物公司进行测序。

1.5 MEOX2基因的生物信息学分析利用多种生物学软件和在线生物信息学分析工具，对MEOX2基因进行序列分析及同源性比较，分析 MEOX2 蛋白的理化性质，预测蛋白亚细胞定位、信号肽和糖基化、磷酸化位点，分析亲 / 疏水性、跨膜位点、二三级结构、保守域和B 细胞抗原表位等生物信息学特征。

2 结果

2.1 MEOX2基因的PCR扩增、克隆与鉴定以肉鸡肺动脉RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR 扩增得到MEOX2目的基因(图1)。回收 PCR 产物纯化后克隆到 pUCm-T 载体，再进行双酶切鉴定 pUCm-T-MEOX2 重组质粒，检测出约为 800 bp 的目的条带(图2)，表明重组质粒构建成功。

图1 MEOX2基因的 PCR 扩增 M.DL2000 DNA Marker;1.PCR产物

2.2 MEOX2基因的生物信息学分析

2.2.1MEOX2基因同源性分析 测序结果使用DNAStar 软件进行序列分析。本试验克隆出的MEOX2基因的开放阅读框为 819 bp，编码 273 个氨基酸，与前期预计结果一致。测序结果使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上发表的基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性比对，使用DNAStar中的 MegAlign进行核苷酸的同源性分析并构建系统进化树。同源性分析结果显示，肉鸡MEOX2基因和原鸡该基因核苷酸序列的同源性为100%；与盔珠鸡的MEOX2基因同源性为98.05%；与日本鹌鹑和火鸡的MEOX2基因同源性分别为 97.8% 和 97.31%；与朱鹮、绿头鸭、柳鹟、鸿雁、白头海雕和阿德利企鹅的MEOX2基因的同源性比对均达96%以上(图3)。系统进化树分析结果显示，肉鸡与原鸡的亲缘关系最紧密，它们属一个小分支(图4)。

2.2.2MEOX2蛋白的理化性质 利用ExPASy Proteomics Server 在线工具ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)对其编码蛋白的理化性质进行预测分析，推测 MEOX2 蛋白的相对分子质量约为30 141.03,理论等电点(theoretical PI)为7.53，总共包含4 122个原子，分子式(formula)为 C1286H2000N414O414S8。在组成 MEOX2 蛋白的20种氨基酸中丝氨酸(Ser)所占的比例最大，达到了12.5%。 MEOX2 蛋白的脂肪指数(aliphatic indix) 为 53.86；带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为30；带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为30;不稳定指数(instability)为66.63，根据 Guruprasad 方法判定 MEOX2 蛋白不稳定(注：不稳定指数小于40，说明是稳定蛋白，反之则是不稳定蛋白)。总平均亲水指数(grand average of hydropathicity)为-1.043，说明该蛋白质是亲水性蛋白。MEOX2 蛋白在体外哺乳动物网状红细胞中的半衰期为30 h，在酵母体内的半衰期大于20 h，在大肠埃希菌体内的半衰期大于10 h。

图3 不同物种MEOX2基因同源性比较结果

图4 MEOX2基因系统进化树构建结果

2.2.3MEOX2蛋白磷酸化位点和糖基化位点分析 磷酸化与蛋白质的功能密切相关，其是最重要的蛋白质翻译后修饰之一。随着生物信息学的发展，对磷酸化位点的预测和发现已成为生物信息学焦点问题之一。

通过 NetPhos3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测 MEOX2 蛋白磷酸化位点发现(图5)，当潜在磷酸化位点的阈值为0.5时，MEOX2 蛋白存在45个磷酸化位点，其中包括31个丝氨酸(Ser)位点(3,7,12,13,14,15,17,32,67,68,76,91,92,98,100,101,102,124,132,137,139,140,142,149,153,241,254,260,263,266,267)；11个苏氨酸(Thr)位点(21,59,105,106,107,128,163,181,195,222,234)；3个酪氨酸(Tyr)位点(23,118,147)。

图5 MEOX2蛋白磷酸化位点预测结果

经 NetNGlyc1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 软件进行潜在糖基化位点预测，结果发现第 99位(0.625 3)存在1个 N-糖基化修饰位点：99-NSSS(图6)。

图6 MEOX2 蛋白糖基化位点预测结果

2.2.4MEOX2 蛋白亚细胞定位和信号肽 运用Predictprotein (https://www.predictprotein.org/)、Cell-PLoc2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)、SignalP4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/) 预测 MEOX2 蛋白亚细胞定位和信号肽。根据 Predictprotein、Cell-PLoc 分类器得到的分析结果最终确定有92%的可能 MEOX2 蛋白在细胞核中被发现(图7)。同时，利用SignalP4.0 Server对肉鸡肺动脉MEOX2 蛋白进行信号肽预测，结果显示MEOX2 蛋白C、Y最大值分别为0.107和0.112；S的平均值为0.114(图8)。其中Y的最大值代表信号肽的剪切位点；C的最大值代表裂解位点；而信号肽数值(S)平均值则以0.5为限，用以区分分泌蛋白和非分泌蛋白。经预测结果分析得知MEOX2蛋白无信号肽序列，为非分泌蛋白，整个编码序列可完全用于原核表达。

图7 MEOX2 蛋白的亚细胞定位预测

图8 SignalP 基于神经网络算法预测MEOX2 信号肽 C．剪切位点分值；S.信号肽分值；Y.综合剪切点分值

2.2.5MEOX2蛋白的亲/疏水性及跨膜结构域 利用 ExPASy ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)在线分析系统预测 MEOX2 的亲疏水性，MEOX2 蛋白疏水性最高分值为1.522，亲水性最高分值为-3.367(图9)，均匀分布的低分值亲水性氨基酸构成MEOX2多肽链的大部分，整条多肽链表现为亲水性氨基酸。这也与 ExPASy ProtParam 在线分析系统预测得到的总平均疏水指数(GRAVY=-1.043) 结果符合。此外，MEOX2 没有明显的疏水区域，可推测其中没有跨膜区。经 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析，MEOX2 氨基酸序列无明显的跨膜区域(图10)。

图9 MEOX2 蛋白的疏水性、亲水性预测

2.2.6MEOX2 蛋白的二三级结构 应用 SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)软件进行 MEOX2 蛋白二级结构预测，结果显示在 MEOX2 氨基酸序列中有62个 α-螺旋区域(alpha helix)、27个延伸链(extended strand)、10个β-转角(beta turn)、173个无规则卷曲(random coil)，分别占二级结构的22.79%，9.93%，3.68%和63.60%(图11)。经 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)预测，MEOX2 蛋白三级结构存在多个α-螺旋，其主要以无规卷曲为主(图12)，与二级结构预测结果基本一致。

图10 MEOX2 蛋白的跨膜结构域预测结果

图11 MEOX2 蛋白的二级结构预测 蓝色.α-螺旋;紫色.无规则卷曲;红色.延伸链;绿色.β-转角

图12 MEOX2 蛋白的三级结构预测 红色.α-螺旋;黄色.β-转角;绿色.无规则卷曲;蓝色.延伸链

2.2.7MEOX2 蛋白的抗原肽与保守域 运用BepiPred 1.0b Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/)预测 MEOX2 蛋白有11个B 细胞抗原表位(临界值0.35)，其中 84，85，86位点的抗原性指数较高(表1)。使用 NCBI 在线蛋白保守区分析工具 Conserved Domain Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对 MEOX2 蛋白进行分析，结果见图13。

3 讨论

AS已成为严重制约肉鸡养殖业发展的全球性难题，在AS的发生发展过程中肺动脉高压与之密切相关，而MEOX2 基因作为可调控血管内皮细胞增殖和分化的转录因子可能会抑制AS的发生[3]。据国内外研究表明，在人和鼠中MEOX2基因参与了血管的增殖分化过程[17-18]，而对于MEOX2基因与AS之间的联系还未见深入报道。本试验通过 TA 克隆技术扩增得到的目的基因编码区并通过测序获得MEOX2基因的核酸序列，运用生物信息学软件进行序列分析；对其编码蛋白质进行生物信息学预测，为研究MEOX2基因的功能和特性提供依据。

表1 MEOX2 蛋白抗原肽预测

图13 MEOX2 蛋白保守域

与 GenBank发表的其他种属的MEOX2基因进行同源性比对，结果显示肉鸡与原鸡、盔珠鸡、火鸡、日本鹌鹑、朱鹮、绿头鸭、柳鹟、鸿雁、白头海雕和阿德利企鹅氨基酸序列同源性均达 96%以上；系统进化树结果显示，肉鸡与原鸡亲缘关系最近，而与柳鹟的亲缘关系较远，其系统进化树结果与同源性比对结果有一定程度的符合，相似性在一定程度上可反映出物种间同一基因序列的保守性，也说明MEOX2基因的编码区具有较强的保守性。通过生物信息学软件 ProtParam 预测其理化性质，了解其相对分子质量、理论等电点和氨基酸组成等情况，其预测结果对优化克隆和表达，提高蛋白表达效率具有正面作用。

MEOX2 蛋白存在多个磷酸化位点和1个N-糖基化潜在位点，其磷酸化位点包括31个丝氨酸位点，11个苏氨酸位点，3个酪氨酸位点；蛋白磷酸化和糖基化都具有亚细胞定位、修饰和调控蛋白质功能构象和稳定性、调节细胞功能和信号传递等重要作用[19-20]。经 Predictprotein、Cell-PLoc预测ME-OX2蛋白集中分布于细胞核，这与其富含磷酸化位点相互关联，因此推测蛋白质的磷酸化对 MEOX2 蛋白的生物学功能具有重要的调节能力，更进一步说明 MEOX2 蛋白在调节细胞完整性和信号传导途径等功能中发挥作用[21-22]。经 SignalP4.0 预测 MEOX2 蛋白无信号肽，根据信号肽的长度的 S-平均得分预测其不属于分泌蛋白，解释了该结构不具有将蛋白质导入不同膜结构的亚细胞器内的功能，这也验证了亚细胞定位的预测结果[23]。

据报道，判定某种蛋白是否为跨膜蛋白时其亲/疏水性可作为评判依据，在氨基酸序列中，如果发现存在多个亲水/疏水区域，则它通常可用作跨膜蛋白的标记，跨膜蛋白也往往是受体等的作用位点[24-25]。因此，分析亲/疏水区和跨膜结构对于分析一个蛋白质的性质具有一定的意义。在该研究中，ExPASy ProtScale 用于预测 MEOX2 蛋白，结果表明其为亲水性蛋白，据其没有明显的疏水区，推测其可能不存在跨膜区，并使用 TMHMM 进一步预测证实MEOX2蛋白中没有明显的跨膜区，由此推断MEOX2 蛋白可能不是一个膜蛋白，这也与预测其不属于分泌蛋白结果一致，说明 MEOX2 蛋白可通过接受外来信号，在参与细胞调控，维持稳态等方面具有一定作用[26]。

抗原表位是蛋白质抗原性的基础，通过将抗原与T/B细胞抗原受体(TCR/BCR)或特异性抗体结合从而发挥作用；表位预测是基于抗原的氨基酸序列、二三维结构及蛋白质的相关特性，如亲水性、柔性等决定[27]。表位具有易变形和强塑性等特点，因此β-转角和无规卷曲通常是构成抗原表位的重要结构；而ɑ-螺旋和β-折叠结构稳定、不易变形，一般作为蛋白的骨架[28]。通过SOPMA预测 MEOX2 蛋白二级结构发现无规则卷曲和β-转角在二级结构中占较大比例，同时 MEOX2 蛋白具有多个亲水和柔韧蛋白区域，由此推测该蛋白具有形成B细胞表位的结构基础，并且在本试验中通过BepiPred1.0b Server获得的B细胞表位得到验证，因此推测 MEOX2 蛋白可能具有较佳的免疫原性。

综上所述，MEOX2基因保守性较高，存在多个磷酸化位点和1个糖基化位点，为亲水性蛋白且由于集中分布于细胞核，故其不存在跨膜结构，不属于分泌蛋白，可参与个体发育过程的转录调控并可能具有较好的免疫原性。MEOX2基因的成功克隆及其表达载体构建和生物信息学分析的预测结果，为进一步研究MEOX2基因原核高效表达、蛋白纯化提供参考并为其与AS之间的联系奠定基础。