HOST2 lncRNA靶向结合miR-211干预卵巢癌细胞转移的机制研究

热孜亚·库尔班， 古力米热·布然江，古扎丽努尔·阿不力孜

(新疆医科大学附属肿瘤医院妇科，新疆 乌鲁木齐 830011)

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，常见致死亚型为卵巢上皮细胞癌及恶性生殖细胞瘤[1]，卵巢上皮细胞癌的致死率一直高居不下[2]，这与卵巢上皮癌细胞的转移及浸润具有密不可分的关系。卵巢癌早期症状不明显，目前对于高危患者的诊断又局限于对病变区域的组织病理学检测，因此确诊时较多患者已处于转移阶段。近年来随着风险分层及分子档案对早期诊断的干预，寻找早期卵巢癌转移的分子标志物并探究其作用的分子机制迫在眉睫[3]。卵巢癌特异性转录子2 lncRNA(ovarian cancer-specific transcripts 2 lncRNA,HOST2 lncRNA)在卵巢癌细胞株中特异性表达[4]，在多项研究中被证实对卵巢癌的发生发展具有重要作用。另一方面，微小RNA-211(microRNA-211，miR-211)在多种肿瘤分子生物途径中发挥抑癌作用并参与调控肿瘤细胞的转移及浸润[5]，多种生物信息学手段分析预测HOST2 lncRNA与miR-211二者间存在靶向结合位点，而其在卵巢癌中的相关未见报道，本研究旨在探究HOST2 lncRNA与miR-211在卵巢癌细胞转移中的作用机制，为卵巢癌的分子诊断及预后提供可参考的临床分子标志物。

1 材料与方法

1.1材料 人正常卵巢细胞株HOSEpiC，人卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR3、A2780、3AO、CoC1、HO-8910、Caov-4均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基及McCoy′s 5a培养基等均购自Gibco；Effectene Transfection Reagent转染试剂(QIAGEN)；Dual-Lucy Assay Kit(北京塞百奥)；TRIzol、反转录试剂盒及荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒等购自碧云天；Transwell小室(Corning)；RIPA细胞裂解液、Bicinchoninic Acid (BCA)蛋白定量试剂盒、4×loading buffer上样缓冲液(Abmole)；anti-SOX4、anti-E-cadherin、anti-Snail1、anti-N-cadherin、anti-GAPDH及山羊抗兔IgG抗体均购自Abcam；HOST2 lncRNA过表达载体、miR-211 mimic及miR-211无序对照物、HOST2-WildType-Reporter、HOST2-Mut-Reporter载体等均由上海生工生物工程有限公司提供；PCR检测引物由金斯瑞设计合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2细胞培养、转染及分组 人正常卵巢HOSEpiC细胞株、卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2780、3AO、CoC1、HO-8910、Caov-4细胞株分别用含10% FBS的RPMI-1640或McCoy′s 5a培养基于T25培养瓶中传代培养，培养条件为37 ℃，5% CO2恒温恒湿；待细胞长至80%汇合度时1∶3消化传代，2～3 d换液一次，取常规培养至对数生长期细胞进行后续实验操作。取对数生长期细胞2～8×104个铺种于24孔板中，将细胞分为转染无序HOST2 lncRNA及miR-211对照物的对照组、转染HOST2 lncRNA过表达载体的HOST2组、共转染HOST2 lncRNA与miR-211 mimic的(HOST2+miR-211)组。待细胞帖壁生长后参照Effectene Transfection Reagent试剂盒说明书分别转染不同基因载体，37 ℃，5% CO2培养箱常规培养24 h，荧光显微镜下观察细胞状态及转染效率，48 h后更换含3 g/mL嘌呤霉素的新鲜完全培养基继续培养，收集稳定传3～5代后的转染细胞系进行功能实验。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 参照TRIzol试剂盒说明书分别提取不同细胞系及稳定转染后的细胞中总RNA，反转录合成相应cDNA，核酸定量仪检测cDNA浓度及质量后参照qRT-PCR试剂盒说明书定量检测相关mRNA表达量，设置反应条件为预变性95 ℃ 5 min；扩增95 ℃变性1 min，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，设置40次循环；溶解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。参照上述条件每个样本配置3个副孔，实验重复3次取均值，同时做阴性对照用以检测反应体系是否存在PCR污染及引物二聚体干扰。用采集到的荧光信号均值相对定量分析相关mRNA在各组细胞中的表达水平变化。

1.4双荧光素酶报告基因实验 克隆含人miR-211靶向结合位点的HOST2 lncRNA的3′UTR区，以构建含HOST2 lncRNA 3′UTR的萤光素酶报告基因质粒(HOST2-WildType-Reporter)，定点突变HOST2 lncRNA 3′UTR中的核心序列ACAAAGG从而构建含HOST2 lncRNA 3′UTR突变体的萤光素酶报告基因质粒(HOST2-Mut-Reporter)，将miR-211 mimic分别与HOST2-WildType-Reporter、HOST2-Mut-Reporter共转染至卵巢癌细胞中，细胞参照Dual-Lucy Assay Kit试剂盒进行预处理，48 h后分别利用化学发光技术检测荧光素酶活性的变化，从而验证miR-211靶向结合并受HOST2 lncRNA调控。

1.5细胞迁移能力检测

1.5.1细胞划痕 将适量细胞铺在6孔板中加入完全培养基常规培养至80%密度，用10 μL微量移液器枪头沿孔中线垂直划痕后，吸除孔内完全培养基，PBS清洗涤1次，更换含2%FBS的低血清培养基2 mL静置于37 ℃ 5% CO2恒温培养箱中愈合培养。倒置显微镜下采集划痕0，24，48 h后细胞划痕愈合情况。

1.5.2Transwell侵袭迁移实验 取各组对数生长期细胞消化，用无血清培养基重悬质细胞密度为2×105/mL，向Transwell小室中分别接种100 μL各组重悬后的细胞，并用无血清培养基补足内室体积至200 μL。向下室即24孔板内加入500～600 μL完全培养基至浸没小室下层，以提供细胞迁移趋化因子。常规培养24 h后弃下室培养基，PBS润洗小室外侧3次，向24孔板内加入600 μL冰75%乙醇固定细胞30 min，吸除乙醇倒置小室至酒精挥干，转移小室至0.1%结晶紫染料中常温避光染色10 min，清水冲洗脱色，用棉棒擦拭内室细胞残留及染料。室温晾干后倒置显微镜下观察穿膜至小室外侧的细胞，拍照并计数。每孔随机选取5个平行视野，每组设置4个副孔，取细胞计数平均值，比较稳定转染后细胞体外迁移能力的变化。体外侵袭实验前一天配置10 mg/mL Matrigel仿生胶用无血清RPMI-1640培养基1∶3稀释，混匀后向小室内膜中央滴加20 μL稀释后的Matrigel胶，平行摇晃至胶平铺在Transwell小室内侧，37 ℃恒温培养箱内包被过夜，后续操作与细胞迁移实验一致。

1.5.3裸鼠腹腔移植瘤模型实验 4～5周龄雌性BALB/c裸鼠18只，体重(18.37±1.69) g， 无特定病原体(specific pathogen free，SPF) 级条件下饲养，动物实验严格遵守动物伦理保护等相关规定。将裸鼠随机分为3组，每组6只，适应性喂养1～2周后进行实验。常规消化收集稳转后对数生长期的各组细胞，计数活细胞数量，用PBS重悬调整细胞浓度至1×107个细胞，过70 μm无菌尼龙滤网后静置于冰上待用。裸鼠腹部消毒3次，用0.5 mm无菌注射器吸取细胞悬液200 μL，在裸鼠右下腹45°角突破腹膜缓慢注入细胞悬液，旋转拔出针头并再次消毒腹部皮肤。接瘤后SPF环境下常规喂养，每周观察并记录裸鼠生存状态，检测体重变化同时采用NightOWL ⅡLB 983活体成像系统监测裸鼠腹腔移植瘤形成及转移情况。8周后脱颈脱臼法处死小鼠，解剖观察裸鼠各器官远端转移情况。

1.6Western Blot 将转染后各单层生长的帖壁细胞用冰PBS洗涤2次，加入1 mL含1% PMSF的RIPA裂解液轻轻摇晃平铺于培养瓶内壁，冰浴裂解30 min，用细胞刮将细胞刮下转移至1.5 mL EP管中4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，转移上清至新的EP管中，BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白，各取100 mg蛋白加入等体积稀释后的1×SDS上样缓冲液沸水浴10 min变性蛋白。向每个上样孔中加入等量蛋白后行10% SDS-PAGE凝胶电泳，120 V恒压电泳90 min；电泳结束后将凝胶转移至电转仪将上述蛋白转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上，常规抗体孵育后进化学发光成像系统(Bio-Rad ChemiDoc XRS system)内爆光显影，采集发光图像进行相对定量分析，以GAPDH为内参蛋白，实验重复3次。

1.7统计学方法 应用GraphPad Prism 5统计软件分析数据。计量资料采用单因素方差分析、独立样本t检验、SNK-q检验和重复测量的方差分析，相关性分析采用Spearman等级相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同细胞系中HOST2 lncRNA及miR-211表达相关性 qRT-PCR检测多种卵巢癌细胞系较人正常卵巢细胞中HOST2 lncRNA与miR-211表达差异倍数变数变化，结果显示，HOST2 lncRNA高表达于多种卵巢癌细胞系中，且在SKOV3细胞中显示出显著高表达；miR-211在多种卵巢癌细胞系中低表达，且在SKOV3细胞中表达量最低。HOST2 lncRNA与miR-211在卵巢癌细胞系中成显著负相关(rs=-0.857，P<0.05)，并选择其中差异表达倍数最高的SKOV3细胞系用作后续实验研究。见表2。

表2 不同细胞系中HOST2 lncRNA及miR-211表达相关性Table 2 Expressive relevance of HOST2 lncRNA and microRNA-211 in different cell lines

2.2miR-211靶向结合HOST2 lncRNA 双荧光素酶报告基因实验检测miR-211与HOST2 lncRNA间靶向相关性。结果显示共转染野生型HOST2-WT报告基因质粒与miR-211 mimic后HOST2荧光素酶强度较对照组显著减弱，差异有统计学意义(P<0.01)；定点突变3′UTR区靶向结合为位点后共转染突变体HOST2-Mut与miR-211 mimic对荧光素酶活性无影响，差异无统计学意义(P>0.05)。进一步通过qRT-PCR检测各组稳转细胞系中HOST2过表达载体及miR-211 mimic对细胞内HOST2 lncRNA及miR-211表达影响，结果显示过表达HOST2显著提高细胞内HOST2 lncRNA的表达水平并抑制miR-211表达，差异有统计学意义(P<0.05)，同时转染miR-211 mimic促进细胞内miR-211表达而对细胞内HOST2 lncRNA的表达水平无影响，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，4，图1。

图1 HOST2 lncRNA与miR-211靶向相关序列及突变位点

表3 miR-211 mimic与HOST2荧光素酶报告基因质粒共转染SKOV3细胞后相对荧光素酶活性变化Table 3 Change of relative luciferase activity of Co-transfection of mimic and HOST2 luciferase reporter gene plasmid into SKOV3 cells

表4 过表达HOST2及miR-211后SKOV3细胞内HOST2 lncRNA及miR-211表达变化Table 4 Changes of HOST2 lncRNA and microRNA-211 expression in SKOV3 cells after HOST2 and miR-211 overexpression

2.3HOST2 lncRNA及miR-211对SKOV3卵巢癌细胞体内外转移的影响 HOST2 lncRNA及miR-211对SKOV3卵巢癌细胞体内外转移的影响 过表达HOST2 lncRNA显著促进SKOV3细胞体外侵袭和迁移能力，促进细胞划痕愈合，与对照组差异有统计学意义(P<0.001)，同时过表达miR-211则会抑制HOST2 lncRNA对细胞体外转移的促进作用，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。裸鼠体内腹腔移植瘤荧光分布及强度显示，裸鼠体内GFP荧光蛋白强度随时间增强，在腹腔及肾脏出现荧光强度积聚，腹腔移植后4周，过表达HOST2 lncRNA裸鼠体内荧光强度较对照组显著增强，差异有统计学意义(P<0.01)，而miR-211抑制腹腔移植瘤的转移及体内荧光信号强度的增加与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5，图2。

图2 HOST2 lncRNA靶向miR-211调控卵巢癌细胞体内和体外转移

表5 定量分析HOST2 lncRNA靶向miR-211对卵巢癌细胞体内、外转移的抑制能力Table 5 Inhibition quantitative analysis of metastasis in vivo and in vitro when HOST2 lncRNA targeting Mi-211

2.4HOST2 lncRNA靶向miR-211对SKOV3细胞内关键蛋白的表达影响 Western Blot检测3组稳转细胞内与转移相关的蛋白质表达变化，过表达HOST2 lncRNA促进SKOV3细胞内SOX4、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)诱导因子Snail1及间质细胞标志物N-cadherin的表达，同时抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达，差异有统计学意义(P<0.01)。共转染HOST2 lncRNA与miR-211 mimic反之会抑制过表达HOST2 lncRNA对相关蛋白的促进或抑制作用，与对照组细胞相关蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6，图3。

表6 定量分析HOST2 lncRNA靶向miR-211对SKOV3细胞内相关蛋白表达影响Table 6 Quantitative analysis of the effect of HOST2 lncRNA targeting microRNA-211 on the expression of related proteins in SKOV3 cells

图3 Western Blot检测3组稳转细胞内转移相关蛋白表达变化

3 讨 论

非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)在调控肿瘤发生发展中的作用近年来得到广泛验证，其中长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)与微小RNA(microRNAs,miRNAs)在肿瘤调控中的相互作用也逐渐引起注意[6-7]。2011年Karreth等[8]首次提出竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)假说后，可在卵巢癌中发挥类似原癌基因或者抑癌基因作用的miRNAs的相关研究得到广泛报道[9-10]，而仅有ZNF300PI等少数lncRNAs被证实参与调控卵巢癌的生物学功能[11]。由此，笔者基于HOST2 lncRNA与miR-211对卵巢癌细胞生物学功能作用的研究，进一步阐明二者相互作用的机制，现将结果分析如下。

qRT-PCR检测7种人卵巢癌细胞系较人正常卵巢细胞内HOST2 lncRNA与miR-211单拷贝数的变化及二者表达相关性，提示在卵巢上皮细胞癌中HOST2 lncRNA可能发挥类似原癌基因的作用，而miR-211则可能发挥类似抑癌基因的作用。同时二者在细胞内表达呈现显著负相关(P<0.05)，结合生物信息学预测，进一步构建含人miR-211靶向结合位点的HOST2 lncRNA报告基因载体，通过共转染miR-211 mimic与HOST2-WT或HOST2-Mut检测细胞内荧光素酶活性信号变化可知HOST2 lncRNA靶向结合miR-211，过表达HOST2 lncRNA显著提高细胞内HOST2 lncRNA表达并抑制miR-211表达，而同时转染miR-211 mimic在恢复miR-211细胞内表达的同时对HOST2 lncRNA不产生抑制，由此推测miR-211结合但并不降解HOST2 lncRNA表达，HOST2 lncRNA可能作为ceRNA竞争性结合miR-211参与细胞内生物功能的调节。有文献报道，miR-211可靶向结合与性别决定相关的高迁移率基因群4(high mobility gene group 4，SOX4)参与卵巢癌细胞转移[12]，为探究这种调控是否受到HOST2 lncRNA的表达影响，笔者通过一系列体内、外实验检测HOST2 lncRNA与miR-211对SKOV3细胞转移的作用。HOST2 lncRNA高表达促进SKOV3细胞体内外的转移，共转染miR-211 mimic及HOST2 lncRNA过表达载体反而会抑制HOST2 lncRNA对细胞转移的促进作用。进一步检测细胞内SOX4的表达变化及EMT相关信号分子表达情况，研究表明过表达HOST2 lncRNA促进SOX4表达，miR-211抑制SOX4在细胞内的积聚，EMT诱导关键因子Snail1的表达随HOST2 lncRNA的增加而升高，上皮细胞向间质转化标志物N-cadherin增加，上皮类细胞标志物E-cadherin减少，反之共转染miR-211 mimic会逆转上述蛋白表达变化，细胞内关键蛋白表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果均表明HOST2 lncRNA促进EMT发生，通过竞争性结合SOX4与miR-211促进miR-211海绵吸附HOST2 lncRNA进而诱导SOX4的释放和积聚，最终促进Snail1的表达，诱发EMT的发生[13-14]。

以上结果初步探讨了HOST2 lncRNA促进卵巢上皮细胞癌发生转移的机制及调控的关键信号分子，而HOST2 lncRNA靶向miR-211是否能作为独立的临床诊断及预后因子仍需要大样本临床数据的分析及检验；另一方面， miR-211靶向结合不降解HOST2 lncRNA的机制仍有待探索，在以往的研究中，miR-21与lncRNA-GAS5[15]、miR-200与lncRNA-ATB[16]的相互作用中均显示出一致的作用方式，但其机制尚不明确。综上所述，HOST2 lncRNA可竞争性结合内源miR-211促进卵巢癌细胞的转移，HOST2 lncRNA可能作为潜在的卵巢癌生物标记物，为临床诊断提供新的实验依据。