初治弥漫大B细胞淋巴瘤患者hsa-miR-23a、hsa-miR-566表达水平及其临床意义

陶盛能，张旭晗，张 睿，朱小玉，王小华

(1.安徽省芜湖市第二人民医院血液内科，安徽 芜湖 241000；2.中国科学技术大学第一附属医院血液内科，安徽 合肥 230000；3.安徽医科大学第四附属医院血液内科，安徽 合肥 230000)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)在我国发病率占非霍奇金淋巴瘤患者的30%～40%[1-2]。该疾病无论是在组织形态学、临床表现，还是预后均具有显著的特异性。近年来DLBCL病理亚型及生物治疗的相关科研均取得一定的进展，但仍有部分患者在接受DLBCL的一线药物(如妥昔单抗、阿霉素、长春新碱、泼尼松龙、环磷酰胺)治疗后的效果较差，且很快出现耐药性，导致部分患者预后不佳[3-4]。在肿瘤miRNAs表达谱中，有研究证实hsa-miR-23a-3p可促进乳腺癌细胞复制增加并增加耐药癌基因的表达[5]；在肾细胞癌中miR-566低表达患者生存期更长[6]。然而，关于外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平与DLBCL患者临床特征及预后生存期的关系研究尚未见报道。故本研究通过探究DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平及其临床意义，旨以DLBCL的诊治及预后研判提供一种新思路，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年5月—2019年1月安徽省芜湖市第二人民医院收治的DLBCL患者作为研究对象。纳入标准：①临床资料完整，年龄>18岁；②符合中华医学会血液学分会2013年制订的DLBCL诊断标准[7]；③在取标本时，患者尚未经过任何治疗；④患者均接受足够疗程的R-CHOP(R为利妥昔单克隆抗体，C为环磷酰胺，H为阿霉素，O为长春新碱，P为泼尼松)化疗方案。排除标准：①心、脑、肺、肝、肾等器官功能严重损害者；②有长期进行激素药物治疗史者；③对化疗药物过敏者；④中途失访或转院治疗者。符合上述纳入和排除标准的患者共60例，并将其纳入观察组，男性36例，女性24例，年龄18～72岁，平均(55.78±8.93)岁。根据参照匹对原则，选取60例体检健康者作为对照组，男性35例，女性25例，年龄18～71岁，平均(54.24±8.75)岁。观察组与对照组的性别、年龄等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者知情并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566指标检测 于治疗前抽取DLBCL患者空腹静脉血5 mL，同时收集健康者体检时的静脉血，3 000 r/min离心10 min后，分离血清,收集上层清液进行检测。采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的miRNA Vana PARIS试剂盒，按照说明书对血清的总RNA进行提取。采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的TaqMan miRNA试剂盒进行逆转录反应。hsa-miR-23a-3p上游引物：5′-ATCCAGTAA-GGACTG-3′； hsa-miR-23a-3p下游引物：5′-CGAATCAGGACTCGTC-3′； hsa-miR-566上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATG-3′； hsa-miR-566下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′。完成逆转录反应。采用荧光定量PCR法检测，以U6为内参，40个循环(95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min)延伸72 ℃(7 min)。每个标本均重复3次，取平均值。根据公式2-△△CT计算hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566的相对表达量。

1.2.2预后随访 对60 例DLBCL患者出院后通过电话、门诊等多方式进行随访。预后定义，起点时间：DLBCL患者开始治疗的时间；终点事件：包括DLBCL病情进展、死亡，或随访期间内出现失访者；终点时间：存活，且能随访到的患者，以2019年11月30日为随访截止时间，失访者以最后1次随访时间为终点时间，生存时间为终点时间减去起点时间。

1.3观察指标 ①观察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566在初治DLBCL患者与健康人群的差异。②观察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566与DLBCL患者临床特征[性别、年龄、肿瘤分期、淋巴结区受累数、国际预后指数(international prognostic index，IPI)、血清乳酸脱氢酶浓度(lactic dehydrogenase，LDH)]的关系。③观察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平对DLBCL患者生存时间的影响。

1.4统计学方法 应用SPSS 17.0软件分析数据。计量资料比较采用独立样本的t检验；计数资料比较采用χ2检验；生存分析采用 Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1观察组与对照组的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平比较 观察组患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 观察组与对照组的hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平比较Table 1 Comparison of expression levels of hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-566 between the observation group and the control group

2.2外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平与DLBCL患者临床特征的关系 DLBCL患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平在不同年龄、性别、LDH指标组的表达差异无统计学意义(P均>0.05)，在不同肿瘤分型、淋巴结区受累数、IPI积分中的表达，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平与DLBCL患者的临床特征关系Table 2 The relationship between the expression levels of hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-566 in peripheral blood and the clinical characteristics of DLBCL patients

2.3外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平对DLBCL患者生存时间的影响 至随访截止时间，60例DLBCL患者的随访时间为9～60个月，平均中位随访时间29.82个月，死亡28例，无病例失访。分别以患者外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表达水平均数3.35、1.69作为分割临界值，将患者分为hsa-miR-23a-3p高表达组(32例)、hsa-miR-23a-3p低表达组(28例)；hsa-miR-566高表达组(29例)、hsa-miR-566低表达组(31例)。其中hsa-miR-23a-3p高表达组3年总生存率为40.63%(13/32)，明显低于低表达组的67.86%(19/28)，差异有统计学意义(χ2=4.450，P=0.035)；hsa-miR-23a-3p高表达组、hsa-miR-23a-3p低表达组的中位生存时间分别为26.73个月和32.52个月(P<0.001)，见图1。hsa-miR-566高表达组3年总生存率为37.93%(11/29)，明显低于低表达组67.74%(21/31)，差异有统计学意义(χ2=5.350，P=0.021)；hsa-miR-566高表达组、hsa-miR-566低表达组的中位生存时间分别为27.45个月和32.35个月(P<0.001)，见图2。

图1 DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p高表达与低表达的生存曲线

图2 DLBCL患者外周血hsa-miR-566高表达与低表达的生存曲线

3 讨 论

DLBCL是一类形态学、免疫分型及分子机制极为复杂的恶性淋巴瘤，导致目前临床科研对DLBCL具体分型标志、发生机制及早期标志物的寻找仍存在较大盲区[8-9]。致使部分DLCBL患者的治疗疗效仍较差，且部分患者极易出现耐药情况[10]，进而影响患者的生存期。导致这一因素可能与肿瘤细胞自我更新能力增强有关。而肿瘤细胞更新能力、凋亡受阻、分化能力障碍而致细胞停滞于发育的不同阶段均涉及多种癌基因、抑癌基因及复杂的信号通路。因此，寻找与DLBCL相关基因标志物已成为临床科研的重点。

以高度保守型的内源性非编码微小分子RNA(microRNA，miRNA)广泛涉及到生命的重要过程，如细胞增殖、代谢、迁移、分化等[11]。正常表达的miRNA 能够调控细胞分化、增殖，但异常表达则可促进肿瘤发生、发展[12]。目前至少约有30个miRNA已被发现与DLBCL 的发生发展过程相关[13]。本研究发现DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p表达水平均高于健康人群，且与DLBCL患者的肿瘤分期、淋巴结区受累数及IPI指数存在显著相关。提示外周血hsa-miR-23a-3p表达水平可能参与DLBCL发生发展。hsa-miR-23a-3p属于miR-23的亚型，参与细胞发育的各个阶段，在结肠癌、肺癌等恶性肿瘤中呈高表达，属于致癌基因。高表达的miR-hsa-23a可作为RUNX2靶点通过挽救受损细胞生长发挥致癌基因的作用[14]。RUNX2恰好是致癌转录因子RUNX家族成员，在癌变的发展过程中，可帮助受损的癌细胞增殖、迁移、侵袭[15]。因此hsa-miR-23a-3p表达上调还可反映肿瘤分期、淋巴结区受累情况。本研究还发现DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p高表达组的3年总生存率、中位生存时间均低于低表达患者。这与Wang等[16]研究提到的hsa-miR-23a-3p高表达是DLBCL预后不良标志物的结论完全相符。因为hsa-miR-23a-3p表达上调不仅可通过靶向性抑制作用，发挥促进癌细胞增殖、转移，加快其侵袭进程的作用。还可抑制编码蛋白质的转移抑制因子1[17]，促使肿瘤细胞快速转移，进而影响患者预后。

抑制血管新生成一直被临床认为是治疗肿瘤的主要方向。在基因信息学预测提示中，VHL基因是hsa-miR-566的调控靶点，VHL(Von Hippel-Lindau)基因定位于 3p25～26 区，是一种重要的肿瘤抑制基因。hsa-miR-566表达上调可通过作用于VH基因L，从而影响血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，而VEGF的表达水平被认为在DLBCL 发生发展中发挥重要作用[18]。因为VEGF可通过旁分泌在DLBCL中发挥生物学作用，如刺激血管内皮细胞促使其增殖形成新生血管[19]，提高癌细胞增殖活性，体现出癌变及恶性度的变化，从而影响患者预后。本研究发现DLBCL患者外周血hsa-miR-566高于健康人群，且与DLBCL患者的肿瘤分期、淋巴结区受累数及IPI指数存在显著相关。说明外周血hsa-miR-566不仅参与DLBCL发生过程，可能还通过分子多层级联介导DLBCL患者预后。在人类胶质母细胞瘤中，hsa-miR-566表达下调能促进VHL的表达[20]，而VHL是肿瘤抑制基因，其表达上调有利于患者病情转归。相反，当hsa-miR-566表达上调时，则不能很好的促进VHL表达，致使这种肿瘤抑制基因功能消弱，从而影响患者预后。孙鹤立等[21]研究也提到hsa-miR-566上调可能使DLBCL患者产生较差结局。本研究也发现DLBCL患者外周血hsa-miR-566高表达组的3年总生存率、中位生存时间均低于低表达患者，与上述结论相符。但目前关于hsa-miR-566表达水平与不同肿瘤的相关研究较少，其在DLBCL中的具体作用机制是通过何种通路调节靶基因的表达，尚有待进一步探索。

综上所述，初治DLBCL患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566均呈高表达，且与临床分期、淋巴结区受累数、IPI指数及生存期存在密切联系。两项指标有望成为诊断DLBCL的重要标记物。