碳青霉烯类耐药革兰阴性菌对黏菌素和多黏菌素B的药敏试验方法学评价

郭 燕， 尹丹丹， 胡付品， 高晶晶， 何丽华， 吴文娟， 孙景勇， 倪语星， 汤 瑾，余佳佳， 刘 瑛， 田东兴， 张 泓， 刘文健， 赵 虎， 李 敏

碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的药物之一[1]。随着临床上碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌的出现及在全球的流行播散，该类耐药细菌已成为威胁人类健康的全球重大公共卫生问题。由于产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌及一些多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对多黏菌素类抗菌药物耐药率低，本类药物重新成为多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗的选用药物之一。对于黏菌素或多黏菌素B的药敏试验，当前欧洲共同体药敏试验委员会（EUCAST）和美国临床和实验室标准化协会（CLSI）仅推荐肉汤微量稀释法可作为测定其最低抑菌浓度（MIC）的标准药敏试验方法[2]，但由于该药敏方法在医院临床微生物实验室尚难以开展，目前还在采用其他方法检测多黏菌素的药敏。为了解这些方法与标准肉汤微量稀释法的差异，本次多中心研究纳入上海市8所三级医院，在规定时间内收集非重复的临床上碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌统一进行方法学比较，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌来源 收集2018年9月1日－12月31日上海市8所教学医院（包括7所综合性医院和1所儿童医院）的临床分离碳青霉烯类耐药革兰阴性菌1 040株，具体菌种和菌株数见表1，剔除同一患者相同部位重复菌株。中心实验室在此期间将收集到的所有细菌复核鉴定确认后冻存于-80 ℃冰箱，待试验开始时从低温冰箱取出，复苏和转种后进行试验。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.1.2 标准品 黏菌素（批号130327-200906，效价22740 UNITs/mg）和多黏菌素B（批号130313-201310，效价7791 UNITs/mg）购自中国食品药品检定研究院。

1.1.3 药敏试纸 ①多黏菌素B MIC测试条（MIC Test Strip，MTS）试纸系意大利利飞驰公司产品，测定的浓度范围为0.06～1 024 mg/L；②多黏菌素B梳状条（E strip）系温州康泰公司产品，测定的浓度范围为0.064～256 mg/L；③黏菌素E试验条系法国生物梅里埃公司产品，测定的浓度范围为0.016～256 mg/L；④黏菌素和多黏菌素B纸片系英国OXOID公司产品。

1.1.4 VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定药敏仪 革兰阴性菌中国定制药敏卡N335系法国生物梅里埃公司产品，测定的浓度范围为0.5～16 mg/ L。

1.1.5 培养基和试剂 Mueller-Hintor琼脂（MHA）为英国OXOID公司产品。肉汤微量稀释法药敏试验用的阳离子调节肉汤（cation adjusted Mueller-Hinton broth， CAMHB）为美国BBL公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验方法 肉汤微量稀释法按2018年CLSI M07-A11[3]（需氧菌的抗菌药物稀释法敏感性试验）推荐的微量稀释法进行，在本研究中为药敏试验方法学比较的参考方法（金标准）。纸片扩散法和各类试条的梯度扩散法按CLSI M02- A13[4]（抗菌药物纸片敏感性试验执行标准）推荐；VITEK 2-Compact及N335板卡按制造商说明书要求进行。

1.2.2 方法学评价指标[5]①基本一致率（essential agreement， EA）：被评估的方法检测获得的MIC与肉汤微量稀释法获得的MIC值相差±1个稀释度的菌株百分比；②分类一致率（categorical agreement，CA）：按照折点标准，与参考方法相比，两者获得的敏感、中介、耐药结果完全一致菌株的百分比；③小误差（minor error，mE）：菌株在同一折点判断标准下，评估方法将金标准方法做出的中介菌株判定为敏感或耐药；④重大误差（major errors，ME）：即评估方法将金标准方法做出的敏感菌株判定为耐药（假耐药）；⑤非常重大误差（very major errors，VME）：即评估方法将金标准方法做出的耐药菌株判定为敏感（假敏感）；⑥可接受误差范围为：EA和CA均 ≥90%、mE≤10%、ME≤3%和VME≤1.5%。

1.2.3 数据分析 采用WHONET 5.6软件[6]进行药敏结果的统计分析。折点可按CLSI M100（2019年版）的推荐[7]。如黏菌素为敏感≤2 mg/ L，耐药≥4 mg/L；但多黏菌素B对铜绿假单胞菌敏感 ≤2 mg/L，中介4 mg/L，耐药≥8 mg/L；对不动杆菌属细菌敏感≤2 mg/L，耐药≥4 mg/ L。C L S I目前没有肠杆菌科细菌折点推荐，但其推荐流行病学界值（E C V）可判断野生型（≤2 mg/ L）和非野生型（≥4 mg/L）。纸片法结果可分别采用CLSI M100（2016年版）[8]黏菌素（敏感≥11 mm，耐药≤10 mm）和多黏菌素B（敏感≥12 mm，耐药≤10 mm）对铜绿假单胞菌的折点进行判读。

2 结果

2.1 黏菌素药敏试验方法结果比较

肉汤微量稀释法、E试验法、V I T E K 2-Compact和纸片扩散法药敏试验结果显示，377株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）对黏菌素的敏感率分别为97.3%、97.1%、96.3%和98.1%。317株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（CRPA）对黏菌素的敏感率分别为100%、95.3%、100%和99.1%。346株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）对黏菌素的敏感率分别为99.7%、100%、99.7%和99.7%。见表1。

与标准方法肉汤微量稀释法结果相比，E试验法检测CRKP、CRPA和CRAB药敏的EA分别为87.3%、88.3%和67.9%，E试验法、VITEK 2-Compact和纸片扩散法检测上述菌株的CA均 ＞95%。见表2～表4、图1～图3。

2.2 多黏菌素B药敏试验方法结果比较

肉汤微量稀释法、MTS、E strip和纸片扩散法药敏试验结果显示，377株CRKP对多黏菌素B的敏感率分别为98.1%、97.3%、97.3%和99.2%。317株CRPA对多黏菌素B的敏感率分别为100%、98.7%、99.4%和99.7%。346株CRAB对多黏菌素B的敏感率分别为99.7%、100%、100%和99.7%。见表1。

与标准方法肉汤微量稀释法结果相比，MTS和E strip检测CRKP、CRPA、CRAB的EA分别为13.8%和60.5%、65.0%和95.0%、31.8%和79.2%；而MTS、E strip和纸片扩散法检测上述菌株的CA均＞98%。见表5～表7、图4～图6。

3 讨论

2019年CHINET中国细菌耐药监测结果显示，肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为14.1%和13.5%、31.5%和26.7%、79.9%和80.4%，与2018年资料相比有增长趋势[9]。碳青霉烯类耐药的革兰阴性菌使临床抗感染治疗面临重大挑战，WHO将其列入病原菌危险分类清单“严重致命”级别[10]。多黏菌素作为治疗这类多重耐药革兰阴性菌感染的“重要药物”，实验室快速、准确地测定其药敏试验结果对临床联合抗菌药物选择至关重要。

表1 各种方法测定黏菌素和多黏菌素B的MIC分布Table 1 Distribution of colistin and polymyxin B MICs as determined by different metheds

目前国内临床实验室主要常规药敏试验检测方法为自动化仪器。本研究结果显示，VITEK 2-Compact法检测317株CRPA和346株CRAB对黏菌素的药敏，VME和ME均为0；而对于CRKP，VITEK 2-Compact法的CA为98.4%，但假敏感率为1/9，不在误差可接受范围内。Dafopoulou等[11]报道，采用VITEK 2-Compact法检测41株碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌结果，VME为0，可推荐用作药敏测定方法。然而2017年Chew等[12]采用相同仪器法检测76株肠杆菌科的VME高达36%，认为误差不可接受。可见，VITEK 2-Compact法检测CRKP结果存在较大差异。

图1 黏菌素E试验、VITEK 2-Compact、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定377株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌散点图Figure 1 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 377 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表2 不同方法测定碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对黏菌素敏感性结果一致性比较Table 2 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by different methods

图2 黏菌素 E试验、VITEK 2-Compact、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定317株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌散点图Figure 2 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 317 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

表3 不同方法测定碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌对黏菌素敏感性结果一致性比较Table 3 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa by different methods

图3 黏菌素 E试验、VITEK 2-Compact、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定346株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌散点图Figure 3 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 346 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表4 不同方法测定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对黏菌素敏感性结果一致性比较Table 4 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii by different methods

图4 多黏菌素B MTS、 E strip、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定377株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌散点图Figure 4 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diametersof disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 377 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表5 不同方法测定碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对多黏菌素B敏感性结果一致性比较Table 5 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by different methods

图5 多黏菌素B MTS、E strip、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定317株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌散点图Figure 5 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 317 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

表6 不同方法测定碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌对多黏菌素B敏感性结果一致性比较Table 6 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa by different methods

E试验法操作简单，结果定量，但在临床实验室开展较少。E试验法检测CRKP和CRAB的VME分别为1/9和1/1，而CRPA的VME为0，其总体ME为4.7%。据不同报道，E试验法的VME从9.1%到55.5%不等[13-14]，均明显高于CLSI误差接受标准1.5%，本研究结果与之相似。MTS法和E strip法检测原理、操作步骤与E试验法相似，简单且可获得MIC值。本研究中，MTS法和E strip法检测CRPA对多黏菌素B的敏感性、敏感率和CA均近100%，VME均为0， ME＜3%，而用于检测CRKP和CRAB的VME分别为28.6%和33.3%，存在不可接受的假敏感率。Dafopoulou等[11]采用MTS法检测41株CRKP和20株CRAB对黏菌素的药敏，检出的VME亦高达34.1%和25%。

纸片扩散法成本低，操作简单，结果重复性好，广泛用于微生物实验室。由于目前无黏菌素和多黏菌素B的纸片法折点标准，为便于统计分析，本研究采用2016年CLSI标准中黏菌素和多黏菌素B对铜绿假单胞菌的折点进行判断，结果显示不同菌种间存在差异。采用2016年的折点，纸片扩散法检测CRKP和CRAB的VME则高达33.3%～100%，均不可接受。Galani等[15]采用纸片扩散法测定黏菌素的药敏，铜绿假单胞菌的VME为0；同样的van der Heijden等[16]报道，CRPA对多黏菌素B的药敏， VME高至100%。Gales等[17]采用敏感≥8 mm折点，黏菌素和多黏菌素B对革兰阴性菌的VME为40%；采用敏感≥14 mm折点时，黏菌素的VME为23.3%。因此可见，纸片扩散法由于折点原因检测黏菌素和多黏菌素B的药敏存在较多争议。

图6 多黏菌素B MTS、E strip、纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定346株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌散点图Figure 6 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 346 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表7 不同方法测定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对多黏菌素B敏感性结果一致性比较Table 7 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii by different methods

本研究中，共发现11株黏菌素耐药株，1株为鲍曼不动杆菌，10株为肺炎克雷伯菌，其中1株鲍曼不动杆菌和7株肺炎克雷伯菌对多黏菌素B耐药，耐药株经复测结果保持一致。另外3株肺炎克雷伯菌对多黏菌素B敏感。根据国内流行病学情况[18-19]，选择黏菌素耐药基因mcr-1和mcr-3引物对上述耐药株进行PCR分子生物学检测，结果均为阴性（数据未罗列）。提示医院分离菌株的黏菌素耐药除了质粒介导的mcr基因外，可能还有阴离子荚膜多糖结合、外排泵活化、异质性耐药等其他耐药机制[20]。本研究尚未开展其他相关耐药机制深入探索。

综上所述，本研究中E试验法、V I T E K 2-Compact法、纸片扩散法、MTS和E strip法等检测碳青霉烯类耐药革兰阴性菌（CRKP、CRAB、CRPA）对黏菌素和多黏菌素B敏感性结果均存在EA偏低或假敏感现象（即VME），需引起实验室和临床高度重视。实验室仍应按CLSI相关文件采用标准肉汤稀释法进行多黏菌素药敏试验。此外，由于当前关于多黏菌素的临床治疗研究资料有限，实验室在报告多黏菌素药敏试验结果时，应同时提供相关备注信息以提示临床医师，包括以下内容：① 同时报告多黏菌素的MIC值及其解释分类。② 备注以下警示信息，即黏菌素的MIC值可用于预测多黏菌素B的MIC值；如应用黏菌素/多黏菌素B治疗，应根据肾功能给予最大推荐剂量。③ 临床和PK/PD 数据证实黏菌素和多黏菌素B 临床疗效有限，应联合一个或多个有活性的抗微生物药物。