甘肃耐氨基糖苷类结核分枝杆菌样本相关基因位点的研究

高恺，同重湘，杨增伟 ，吴玲，车团结

1、甘肃省功能基因组与分子诊断重点实验室，甘肃兰州，730000

2、甘肃省传染病院，甘肃兰州，730000

3’甘肃省人民医院检验科，甘肃兰州，730000

根据2012 年世界卫生组织调查显示：2011 年全球确诊MDR-TB 患者310 000 例，其中印度、中国和俄罗斯占60%[2]。MDR-TB、XDR-TB 患者往往预后较差， MDR-TB 若治疗不当，就可能进一步发展成XDR-TB， 后者将面临或已处于无药可治的窘境，在二线抗结核药物中，二线氨基糖类药物对MDR-TB 敏感性较高， 常优先用于治疗MDR-TB[3]。因此对二线氨基糖类药物耐药机制的研究，可进一步了解XDR-TB 发生机制，提高MDR-TB 治愈率，减少XDR-TB 发生。

氨基糖苷类抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，一线氨基糖苷类药物是指用于治疗结核病的链霉素，二线主要指卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素，目前主要用于治疗广泛耐药结核病XDR-TB。

耐多药结核病是结合病治疗中的重点和难点，开展结核分枝杆菌耐药性的动态监测，是病控制工作的重要内容。

材料与方法

一、样本来源

89个结核分枝杆菌临床分离株样本由兰州肺科医院提供，所有样本均进行了氨基糖苷类药物药敏试验；

二、方法

1.痰结核分枝杆菌培养和菌种鉴定及药敏试验。

2.耐多药结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物耐药相关基因rrs与rpsl突变的基因测序及NCBI中的序列比对分析。

三、测序数据分析

本实验用DNAMAN软件分析测序结果，比对是否突变。将NCBI中结核分枝杆菌H37Rv菌株的rrs与rpsl基因与测序样本的rrs与rpsl基因比对，同一株的突变数据与耐药数据相对应分析突变与耐药的关系。

结果

一、药敏试验与测序比对

86个结核分枝杆菌分离株样本中，86个样本中50个对链霉素耐药，耐药率为58.14%。86个样本中5个对卡那霉素耐药。耐药率为5.81%。86个样本中3个对阿米卡星耐药。耐药率为3.4%。86个样本中15个对卷曲霉素耐药。耐药率为17.44%。

表1 耐卷曲霉素样本rrs、rpsl基因突变位点

86个样本中50个对链霉素耐药，耐药率为58.14%。86样本中24个样本在rpsl发生了点突变，临床样本药敏结果显示24个点突变样本：其中9个样本突变类型为A263G，9个样本均对链霉素耐药，其突变耐药率为100%。其中15个样本的突变类型为A128G，15个样本均对链霉素耐药，其突变耐药率为100%。86样本中10个样本在rrs发生了点突变，临床样本药敏结果显示10个点突变样本：其中1株突变类型为G5T，其突变类型对链霉素不耐药。其中2株突变类型为A513C，均对链霉素耐药。其中1株突变类型为C517T，对链霉素耐药。其中2株突变类型为T1030C，其突变类型对链霉素不耐药。其中1株突变类型为A1401G，其突变类型对链霉素耐药。其中2株突变类型为C1456T，均对链霉素耐药。其中1株突变类型为G1481T，其突变类型对链霉素耐药。

表2 耐卡那霉素样本rrs、rpsl基因突变位点

86个样本中5个对卡那霉素耐药。耐药率为5.81%。86样本中24个样本在rpsl发生了点突变，临床样本药敏结果显示24个点突变样本：突变类型rpslA128G共有9个样本，其中5521样本耐药。突变类型rpslA263G共有15个样本，其中5428、5769样本耐药。86样本中10个样本在rrs发生了点突变，临床样本药敏结果显示10个点突变样本：突变类型rrsA1401G、rrsG1484T耐药，耐药样本编号为5428、5461。

86个样本中3个对阿米卡星耐药。耐药率为3.4%。86样本中24个样本在rpsl发生了点突变，临床样本药敏结果显示24个点突变样本：突变类型rpslA128G共有9个样本，其中编号5521样本耐药。突变类型rpslA263G共有15个样本，其中编号5428样本耐药。86样本中10个样本在rrs发生了点突变，临床样本药敏结果显示10个点突变样本：突变类型rrsA1401G、rrsG1484T耐药。耐药样本编号为5428、5461。

86个样本中15个对卷曲霉素耐药。耐药率为17.44%。86样本中24个样本在rpsl发生了点突变，临床样本药敏结果显示24个点突变样本：突变类型rpslA128G共有9个样本，其中编号5521样本耐药。突变类型rpslA263G共有15个样本，其中编号5428样本耐药。86样本中10个样本在rrs发生了点突变，临床样本药敏结果显示10个点突变样本：突变类型rrsA1401G、rrsG1484T耐药，耐药样本编号为5428、5461。

讨论

随着分子生物学技术的发展，发现造成结核分枝杆菌耐药机制与基因突变相关。不同的基因突变使感染人体的结核分枝杆菌产生不同药物耐受性。实时荧光PCR技术将扩增和检测两部和一，具有实时扩增实时检测、高效、快捷、简单、经济等优点，可以同时对结核分枝耐药多个基因同时进行检测，特别适用于大批量检测。

因此应用荧光定量PCR高分辨率熔解曲线法，根据点突变序列熔点变化，实时PCR检测结核分枝杆菌基因组中的耐药相关突变位点变化，以分析耐药情况。对89株耐药结核分枝杆菌进行11种抗结核药物耐药基因检测，和传统的表型检测标准相比较，结果表明链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素药物表型和已知突变基因型检测具有较高的一致性，已知链霉素耐药突变类型rp slA128G、rpslA263G、rrsC517T、rrsA513C与 基因检测一致性为100%。已知二线氨基糖苷类药物（卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素）耐药突变类型rrsA1401G、rrsG1484T与基因检测一致性为100%。

推测突变类型rpslA128G、rpslA263G、rrs C517T、rrsA513C只与链霉素耐药相关。突变类型rrsA1401G、rrsG1484T与链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素交叉耐药相关。突变类型rrsC1456T与链霉素耐药相关，突变类型尚未见相关文献报道，为新的突变位点。