白芍总苷预处理对缺血性脑损伤大鼠血脑屏障保护作用的研究

刘倩菁 刘祖秋 田颖 代小兰

脑血管疾病是严重危害人类生命健康的三大疾病之一，具有较高的致残率和致死率，其中缺血性脑损伤约占60%～80%[1]。脑组织供血不足所致活性氧自由基和炎症细胞因子大量生成导致血脑屏障通透性异常升高，进而引发血管源性脑水肿，是缺血性脑损伤致残、致死的主要原因[2-4]。因此，保护血脑屏障结构和功能完整对减轻缺血性脑损伤具有重要意义。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）是中药白芍的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡等多种药理学作用[5-6]。本课题组前期研究发现TGP通过抑制氧化应激和炎症反应对缺血性脑损伤大鼠中枢海马起到保护作用[7-8]，但TGP对缺血性脑损伤后血脑屏障是否具有保护作用尚不清楚。本实验拟探讨TGP预处理对缺血性脑损伤大鼠血脑屏障的保护作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 清洁级健康成年雄性SD大鼠180只，体重（240±20）g，购自宁波大学实验动物中心[SYXK（浙）2019-0005]。适应性饲养 1周[光照：黑暗12 h∶12 h，温度（25±1）℃，自由饮水进食]后开展实验。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、尼莫地平（nimodipine，NMP）10 mg/（kg·d）预处理组和TGP 50、100、200 mg/（kg·d）预处理组，每组30只。

1.2 主要药物、试剂与仪器 TGP胶囊（宁波立华制药有限公司，规格 0.3 g/粒，批号：201901005）；NMP 胶囊（浙江海力生制药有限公司，规格：20 mg/粒，批号：20190318）；伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司，批号：W20190129）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒和 TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190317、20190128、20190402、20181229、20190130）；兔抗鼠脑组织闭合蛋白（Occludin）、闭锁连接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2、MMP-9、β-actin单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号：201905016、201903031、201904012、201903027、201905023）；MR-96A 型酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；SZ-1型组织匀浆器（江苏金坛市晶玻实验仪器厂）；DYCZ-24DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司）；RM2125型石蜡切片机（德国Leica公司）；BH-2型倒置光学显微镜及摄像（日本Olympus公司）；Allegra 21R型低温离心机（美国Beckman公司）。

1.3 预处理给药 取TGP胶囊内容物并精确称量后，加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度为10、20、40 mg/ml的TGP溶液；取NMP胶囊内容物精确称量，加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度为2 mg/ml的NMP溶液。TGP 50、100、200 mg/（kg·d）预处理组于造模手术前7 d开始给予浓度为 10、20、40 mg/ml的 TGP 溶液（5 ml/kg）灌胃，NMP 10 mg/（kg·d）预处理组给予2 mg/ml的NMP溶液（5 ml/kg）灌胃，假手术组和模型组分别给予0.9%氯化钠溶液（5 ml/kg），均 1次/d。

1.4 缺血性脑损伤大鼠模型的制备 参照李振宗等[9]的报道，采用阻断大脑中动脉的方法制备缺血性脑损伤大鼠模型：术前12 h禁食禁水，麻醉后仰位固定、沿颈部正中切口，钝性剥离右侧颈总动脉至颈外、颈内动脉分叉处，然后动脉夹夹闭颈总动脉、结扎颈外动脉，于颈外动脉残端切口、插栓线（直径0.235 mm，头部灼烧呈钉子帽状）入颈内动脉，遇阻力止，深度距分叉处约18 mm，固定线栓、松开动脉夹后逐层缝合皮肤并消毒处理；假手术组除不切口和插入线栓外，其余同模型组。造模术后24 h行各指标检测。

1.5 血脑屏障通透性检测 采用伊文思蓝渗透法。每组大鼠各随机取10只，以4 ml/kg剂量尾静脉注射2%伊文思蓝溶液，1 h后麻醉、开胸暴露心脏、由左心室-右心耳通路快速灌注300 ml 0.9%氯化钠溶液、断头取脑，称量右半脑重量后研磨匀浆，加3倍量50%的甲酰胺溶液，恒温60℃孵育24 h后3 000 r/min离心15 min，取上清液。酶标仪测定610 nm波长处吸光度值，然后根据标准曲线测定伊文思蓝含量，脑组织伊文思蓝含量可反映血脑屏障通透性。

1.6 脑组织含水量检测 采用干湿比重法。每组大鼠各随机取10只，麻醉后迅速断头剥取脑组织，切取右侧大脑称重为湿重（W1），恒温110℃烘烤24 h至恒重后为干重（W2），脑组织含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

1.7 脑组织生化指标检测 取每组剩余的10只大鼠，麻醉后迅速断头剥取脑组织、切取右侧大脑，剪碎后加入9倍量4℃预冷的裂解液、研磨匀浆制备脑组织匀浆液。

1.7.1 氧化应激指标检测 脑组织匀浆液经3 000 r/min离心10 min后取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，高锰酸钾滴定法测定CAT活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。

1.7.2 炎症细胞因子检测 脑组织匀浆液经3 000 r/min离心10 min后取上清液，按照各ELISA试剂盒操作说明依照步骤处理，通过酶标仪测定炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 含量。

1.7.3 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平检测 采用Western blot法。脑组织匀浆液经恒低温4℃12 000 r/min离心15 min后取上清液，提取总蛋白并采用二奎磷甲酸法（BCA）测定总蛋白含量，然后通过凝胶电泳、转PVDF膜、经5%脱脂奶粉37℃封闭1 h后，滴加兔抗鼠 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9、βactin一抗后，4℃恒温孵育12 h后PBS溶液洗膜，滴加山羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h后PBS洗膜，滴加二氨基联苯胺（DAB）显色；然后以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织血脑屏障通透性检测结果比较与假手术组比较，模型组大鼠脑组织伊文思蓝含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01），提示缺血性脑损伤大鼠血脑屏障通透性明显升高；经TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）预处理7 d则能够明显抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织伊文思蓝含量升高，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），且TGP 200 mg/（kg·d）预处理组大鼠脑组织伊文思蓝含量低于NMP 10 mg/（kg·d）预处理组（P＜0.05），提示TGP预处理具有保护缺血性脑损伤大鼠血脑屏障通透性的作用，见表1。

表1 各组大鼠脑组织血脑屏障通透性检测结果比较

2.2 各组大鼠脑组织含水量比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织含水量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；经TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）预处理7 d则能够明显抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织含水量升高，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且TGP 200 mg/（kg·d）预处理组大鼠脑组织含水量低于NMP 10 mg/（kg·d）预处理组（P＜0.05），提示TGP预处理具有抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织水肿的作用，见表2。

表2 各组大鼠脑组织含水量比较

2.3 各组大鼠脑组织氧化应激指标比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SOD、CAT活性均降低，MDA含量升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；经TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）预处理7 d则能够明显抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织SOD、CAT活性的降低及MDA含量的升高，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）预处理组SOD活性较NMP 10 mg/（kg·d）预处理组升高且MDA含量较NMP 10 mg/（kg·d）预处理组降低（均P＜0.05），但两组大鼠CAT活性比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠脑组织氧化应激指标比较

2.4 各组大鼠脑组织炎症细胞因子含量比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β含量均升高，差异均有统计学意义（均 P＜0.01）；经 TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）预处理7 d则能够明显抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织TNF-α、IL-1β含量的升高，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）预处理组大鼠脑组织TNF-α含量低于NMP 10 mg/（kg·d）预处理组（P＜0.05），但两组大鼠IL-1β含量比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表 4。

2.5 各组大鼠脑组织 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP－9蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Occludin、ZO-1蛋白表达下调而MMP-2、MMP-9蛋白表达上调，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；经TGP 50、100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）预处理7 d则能够明显抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织Occludin蛋白表达的下调和MMP－9蛋白表达的上调，经TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）预处理7 d则能够明显抑制ZO-1蛋白表达的下调和MMP－2蛋白表达的上调，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）预处理组Occludin、ZO-1蛋白表达较NMP 10 mg/（kg·d）预处理组上调而MMP－2表达下调（均P＜0.05），两组大鼠MMP－9蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1-2和表5。

表4 各组大鼠脑组织炎症细胞因子含量比较

3 讨论

血脑屏障能够阻止某些有害物质由血液进入脑组织，对保持中枢神经系统内环境稳定具有重要意义。缺血性脑损伤早期即可出现血脑屏障破坏而引发血管源性脑水肿，是导致脑损伤疾病进展的关键性病理变化。因此，保护血脑屏障结构和功能完整对改善缺血性脑损伤预后具有重要意义。

白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，是我国传统中药品种，医学典籍《本经》中记载白芍具有“除血痹、破坚积、治寒热疝瘕、益气”之功效，《别录》记载白芍具有“通顺血脉、缓中、散恶血、逐贼血”之功效。TGP为中药白芍的主要有效成分，现代药理学研究发现TGP具有良好的抗氧化、抗炎等生物学活性。本实验采用线栓法阻塞大脑中动脉制备缺血性脑损伤大鼠模型，并于造模前7 d开始1次/d灌胃给予TGP进行预处理，并以临床治疗缺血性脑损伤一线用药NMP为阳性对照药物，研究发现经TGP预处理能够有效抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织伊文思蓝含量渗透量和含水量的升高，并且给予TGP 200 mg/（kg·d）预处理效果优于NMP 10 mg/（kg·d）预处理组，提示TGP预处理具有保护缺血性脑损伤大鼠血脑屏障通透性并抑制脑组织水肿的作用。

图1 各组大鼠脑组织闭合蛋白（Occludin）、闭锁连接蛋白-1（ZO-1）蛋白表达的电泳图[A：假手术组；B：模型组；C：尼莫地平（NMP）10 mg/（kg·d）预处理组；D：白芍总苷（TGP）50 mg/（kg·d）预处理组；E：TGP 100 mg/（kg·d）预处理组；F：TGP 200 mg/（kg·d）预处理组]

图2 各组大鼠脑组织基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表达的电泳图[A：假手术组；B：模型组；C：尼莫地平（NMP）10 mg/（kg·d）预处理组；D：白芍总苷（TGP）50 mg/（kg·d）预处理组；E：TGP 100 mg/（kg·d）预处理组；F：TGP 200 mg/（kg·d）预处理组]

表5 各组大鼠脑组织Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较

血脑屏障是内皮细胞依靠紧密连接蛋白复合体（tight junction protein systerm，TJPs）连接构成的三维网状超微结构[10]；TJPs主要由跨膜蛋白、胞质附着蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用形成。其中跨膜蛋白Occludin和胞质附着蛋白ZO-1是构成TJPs的主要成分，两者相互作用组成TJPs的基础结构。此外，Occludin能够封闭内皮细胞之间的间隙，Occludin缺失将导致TJPs细胞突起减少和骨架破坏，所以Occludin对维持血脑屏障结构完整具有至关重要的作用。ZO-1对细胞极性、胞旁屏障、TJPs骨架形成等具有重要作用，ZO-1缺失将直接影响TJPs生成，导致内皮细胞间缝隙增大而使血脑屏障通透性升高[11]。MMP是连接蛋白降解酶系统的重要组成部分，其中MMP-2、MMP-9能够消化降解Occludin蛋白并可消化降解内皮细胞基底层，从而破坏血脑屏障结构[12]。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是机体发生氧化应激反应的物质基础，在血脑屏障损伤病理进展过程中发挥着重要作用。脑组织供血、供氧不足将导致线粒体呼吸链受阻而生成大量的ROS，以ROS为底物的抗氧化酶SOD、CAT过度消耗而不能支撑ROS正常清除，导致ROS代谢失衡而过剩，攻击核酸、蛋白质等大分子发生脂质过氧化反应生成MDA[13]。此外，ROS还将攻击细胞膜而破坏细胞骨架，降解Occludin、ZO-1蛋白而破坏TJPs基础结构，从而破坏血脑屏障完整性[14]。

缺血性脑损伤发生后将病理性刺激炎症细胞因子TNF-α、IL-1β大量释放，两者是触发炎症级联反应的趋化因子，在血脑屏障病理过程中具有重要作用。周喜燕等[15]研究发现TNF-α和IL-1β能够直接破坏TJPs结构，并可通过激活NF-κB而诱导内皮细胞黏附分子上调表达，并与内皮细胞黏附而增加血脑屏障通透性。

本实验发现，大鼠发生缺血性脑损伤后脑组织SOD、CAT活性降低而MDA含量升高，炎症细胞因子TNF-α、IL-1β含量升高，与张思然等[16]的研究报道一致；发现Occludin蛋白表达下调且MMP-2、MMP-9蛋白表达上调，与王少朋等[17]的研究报道一致。经TGP预处理则能够有效抑制缺血性脑损伤大鼠SOD、CAT活性降低和MDA含量升高，抑制TNF-α、IL-1β含量升高，抑制Occludin、ZO-1蛋白表达下调和MMP-2、MMP-9蛋白表达上调；提示TGP对缺血性脑损伤大鼠血脑屏障的保护作用可能与抑制氧化应激、炎症反应以及抑制Occludin、ZO-1蛋白表达下调和MMP-2、MMP-9蛋白表达上调有关。